背景知识：1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phosphate，S1P)是鞘磷脂代谢的中间产物之一，既可作为细胞内第二信使发挥作用，又可通过与细胞表面的特定受体(S1preceptor，S1PR)结合而发挥广泛的生物学效应。S1P在肿瘤发生、心血管系统、免疫系统等方面都有重要的作用，已成为研究热点。体内S1P主要来源于鞘磷脂的分解代谢。鞘氨醇(sphingosine，Sph)合成至S1P的关键酶———Sph激酶(SphKinase，SphK)有两个亚型———SphK1和SphK2，都能催化Sph的腺苷三磷酸(adenosinetriphosphate，ATP)依赖性磷酸化作用而形成S1P。S1P在血浆浓度为0.2～0.9μmol/L，红细胞和血小板是血浆S1P的主要来源。红细胞自身缺乏S1P降解酶是其聚集大量S1P的主要原因之一。在血栓素及钙离子的作用下，血小板亦可储存及释放大量的S1P。除此之外，细胞外来源也可能是血浆S1P来源的机制之一。最近研究发现其在骨代谢也发挥相应的作用，但具体的机制仍然是不清楚的。
骨骼的重塑主要依赖成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收。之前的研究表明破骨细胞分泌的SIP能够刺激成骨细胞分泌RANKL，并且促进成骨细胞的分化。特异性地在破骨上敲除组织蛋白酶k能够通过刺激SPHK1活性增加骨形成，降血钙素能够结合SIP3调控成骨细胞。这些报道都表明SIP在破骨细胞和成骨细胞中扮演着重要的角色。虽然参与的机制，但是它们在正常和病态骨内平衡的相关性仍然不清楚。
于是，作者作出了这样的假设；改变成年小鼠体内S1P水平和梯度是否影响骨稳态和骨量。文章主要内容一、S1P裂解酶的缺失或抑制增加了骨量和骨强度，提高了骨保护素，抑制了破骨细胞二、S1P和S1P2通过p38-GSK3β-β-catenin和非经典wnt5A-lrp5信号通路诱导OPG产生三、抑制S1P裂解酶缓救了Opg敲除小鼠导致的骨质疏松症四、S1P和S1P2通过激活OSTIX和抑制PPARγ调控成骨细胞的分化五、S1P酶缺乏或抑制可减少白色脂肪组织。六、在卵巢切除小鼠模型中，抑制S1P裂解酶，在对骨量保护作用方面与甲状旁腺激素相当，提高骨强度的作用优于甲状旁腺激素一、S1P裂解酶的缺失或抑制增加了骨量和骨强度，提高了骨保护素，抑制了破骨细胞。最开始，作者构建了两个动物模型，通过在小鼠骨骼生长成熟后敲除SIP裂解酶（Sgpl1）得到SIP裂解酶敲除小鼠Sgpl1flox/floxCre+(KO)小鼠。4-脱氧吡哆醇（DOP）是一种特异性的S1P裂解酶抑制剂，它与酶的吡咯醛-5‘-磷酸结合区竞争。使用饮用水给药方式给药（DOP）12周，得到Dop处理的小鼠。结果发现;
SIP裂解酶敲除小鼠Sgpl1flox/floxCre+(KO)小鼠骨量增加，a图中，microCT分析明显看出Sgpl1flox/floxCre+小鼠，小鼠的骨量增加。BV/TV（相对骨体积）比对照组增加4.5倍。Tb.N(骨小梁数量)增加3.7倍，Tb.Sp(骨小梁分离度)比对照组下降27%。B图；作者使用4-脱氧吡哆醇（DOP）抑制S1P裂解酶，microCT分析骨量增加，BV/TV（相对骨体积）比对照组增加1.3倍。Tb.N(骨小梁数量)增加1.7倍，Tb.Sp(骨小梁分离度)比对照组下降24%。Tb.Th（骨小梁厚度）是没有明显不同。
c图，皮质骨，Cr.Th(皮质骨厚度）在抑制SIP裂解酶的小鼠明显增加。BMD（骨密度）是增加28%。三点弯曲试验：将标本放在有一定距离的两个支撑点上，在两个支撑点中点上方向标本施加向下的载荷，标本的3个接触点形成相等的两个力矩时即发生三点弯曲，标本将于中点处发生断裂。d图中，三点弯曲试验分析骨强度，DOP处理组最大载荷比对照组高，弹性模量比对照组低。刚度和最大应力没有不同。
e图，使用改良的vonkossastaining和钙*绿素染色，可以看到DOP处理小鼠，钙*绿素染色标记明显比对照组多。定量分析mineralappositionrate(MAR)矿物质沉淀率增加23%，boneformationrate(BFR/BS)骨形成率没有改变。每骨表面的类骨质表面（OS/BS）降低28%。f图中，TRAP染色可以看到DOP组破骨细胞明显减少，定量分析减少48%.g图中，相对于未处理的对照，DOP处理的小鼠中吡啶啉交联（PYD）的血浆浓度（体内OC活性的量度）减少了56％h图，敲除鼠血浆的opg增加1.4倍，i图，DOP处理小鼠增加2.8倍。j图，rankl浓度降低96%，k图，RANKL/OPGratio降低99%。这些数据表明S1P裂解酶的缺失或抑制增加了骨量和强度，提高了骨保护素，抑制了破骨细胞。接下来；FTY（芬戈莫德）是一种S1P类似物，磷酸化后，作用于五种S1P受体中的四种（S1P2受体除外），这个药物已经被批准用于治疗复发性多发性硬化症
给予WT小鼠注射FTY72后microct分析，注射FTY处理组和对照组，BV/TV（相对骨体积）Tb.N(骨小梁数量),Tb.Sp(骨小梁分离度),Tb.Th（骨小梁厚度）是没有明显不同。
FTY对待对都没有影响因为FTY作用于五种S1P受体中的四种（S1P2受体除外），这表明也许是S1P2介导S1P对骨的作用。二、S1P和S1P2通过p38-GSK3β-β-catenin和非经典wnt5A-lrp5信号途径诱导OPG产生。
在体内实验中，SIP裂解酶缺失或抑制，血浆OPG的量都是明显升高的。接下来，作者开始探索OPG升高的原因。在体外实验中，开始在a图，加入SIP刺激MC3T3-E1细胞24小时，OPG增加2.5倍。OPG基因表达增加5.5倍，加入S1P2抑制剂JTE-后，OPG增加和基因表达是被消除。加入S1P3抑制剂TY是没有被抵消的。
为了严谨证实，作者提取了原代细胞，从小鼠长骨提取的成骨细胞的前体细胞。结果是一致的,OPG蛋白在SIP刺激24小时后增加5.5倍，增加效果也被S1P2抑制剂JTE-消除。而从S1P2敲除小鼠鼠提取的成骨细胞的前体细胞，检测OPG基因的表达在加入SIP刺激后是没有明显改变的。这些表明S1P2是作为负责OPG产生的S1P受体。Opg基因表达受到β-catenin-TCF1通路的转录调控。
c图，加入SIP刺激MC3T3-E1细胞4小时，细胞核内的β-连环蛋白是大量增加，加入S1P2抑制剂JTE-后，增加效果被消除。lICL作为阳性对照.
d图，加入SIP刺激5和10分钟，磷酸化的糖原合酶激酶3β残基9GSK3βSer9是增加的，加入S1P2抑制剂JTE-后，增加效果被消除。然而，GSK3βSer9磷酸化不伴随着Akt激活，因为JTE阻止GSK3βSer9磷酸化，但不阻止S1P对Ser的Akt磷酸化。S1P是增强p38MAPK的磷酸化。JTE完全消除了这种磷酸化.
e图，p38MAPK抑制剂SB消除GSK3β磷酸
p38MAPK抑制剂SB消除了S1P诱导的OPG分泌。这里说明了SIP与SIP2结合后，激活了p38-GSK3β-β-catenin通路，从而促进了OPG的表达。
WNT5A，是被证明是上调TNFRSF11B（OPG）的基因。PCR分析Wnt5a基因的表达；S1P诱导了增加WNT5A基因表达2.9倍，同样，增加的效果是被JTE消除的。SIP2敲除小鼠加入SIP刺激，Wnt5a基因的表达没有改变。
h图中，Wnt受体低密度脂蛋白的表达受体相关蛋白5（Lrp5）也增加了1.8倍。增加的效果被JTE消除，i图中，给予重组Wnt抑制因子1（WIF-1）或WNT5A特异性抑制剂BOX5，明显抑制Opg基因的表达。
SIP通过作用于受体SIP2，通过两个通路刺激OPG的产生，一个是通过p38-GSK3β-β-catenin产生OPG，一个是通过非经典wnt5A-lrp5信号途径诱导OPG产生。这些数据表明，S1P和S1P2通过p38-GSK3β-β-catenin和非经典wnt5A-lrp5信号途径诱导OPG产生。三、抑制S1P裂解酶缓救Opg敲除小鼠导致骨质疏松症。为了进一步验证SIP裂解酶缺失或抑制，SIP量增加导致OPG增加，是小鼠骨量增加的原因，作者构建了OPG敲除小鼠，同时给予SIP裂解酶抑制剂（DOP）处理。结果：
j图，OPG敲除鼠导致严重骨质疏松，对待DOP处理，小鼠骨质疏松缓救。microCT分析，OPG敲除小鼠，DOP处理后，BV/TV增加30倍。WT小鼠，对到DOP处理，BV/TV增加3倍。Tb.N、Tb、Tb.Th明显增加，Tb.Sp明显减少。
皮质骨厚度和骨密度在DOP处理后没有明显改变。
k图，三点弯曲试验分析，DOP处理组在OPG敲除鼠和WT小鼠，最大载荷明显增高。血浆中的rankl，OPG敲除鼠比WT小鼠增高16倍，对待DOP处理，没有明显改变。弹性模量OPG敲除鼠比WT小鼠降低。刚度和最大应力OPG敲除鼠比WT小鼠增高。对待DOP处理，在OPG敲除和WT小鼠没有明显不同。
m图中，TRAP染色，DOP处理的opg敲除小鼠比对照组破骨细胞面积降低69%.n图，测量了血浆前胶原C末端前肽（PICP）的浓度,OB活性指标，在opg敲除鼠和WT小鼠中，DOP处理组够增加40%-50%左右。
对待DOP处理opg敲除小鼠，每骨表面的每骨表面的类骨质表面（OS/BS）是降低的。在另一方面，同样地，对于Sgpl1flox/floxCre+小鼠，和DOP处理WT小鼠，PICP也同样增高。
o、p图，在Sgpl1flox/floxCre+小鼠PICP比对照组增高，在DOP处理的小鼠也同样增高。
ALP染色，Sgpl1flox/floxCre+小鼠成骨细胞面积比对照组增高1.55倍。四、S1P和S1P2通过激活OSTIX和抑制PPARγ调控成骨细胞的分化。
血浆高PICP浓度（OB活性指标）与S1P裂解酶抑制和缺乏有关，SIP刺激OPG的表达，作者开始探索与成骨细胞分化的相关基因。
S1P刺激6h后，骨膜蛋白、骨钙素、骨连接蛋白和Ⅰ型胶原基因的表达增加了3~4倍，在S1PR2敲除小鼠的OB中，S1P对这些基因的表达水平没有影响。
S1P对WT大鼠的钙沉积有明显的促进作用，SIP2敲除小鼠对钙沉积作用也有促进作用，比WT小鼠促进效果降低40%。
SIP能够刺激OB的增殖，增加了1.6倍细胞数量。但是在SIP2敲除小鼠没有作用。
从间充质祖细胞分化成成骨细胞，开始需要协调抑制脂肪生成转录因子，如PPARγ和CCAAT增强子结合蛋白(C/ebp)-α，同时激活成骨细胞转录因子OSTIX，Runx2和β-连环蛋白.
Sp7(Osterix)基因的表达是增加2.7倍，脂肪生成转录因PParg和C/ebp-alpha减少40%和50%。在SIP2敲除后，SIP的增加效果被消除。
同样地，在加入S1P2抑制剂JTE-，Sp7(Osterix)基因的表达是增加效果被消除。RUNX2基因的表达没有改变。接下来，作者检测PPAR-γ的几个直接转录靶基因，CD36、CFD(脂素)、FABP4和LPL(编码脂蛋白脂肪酶)基因
S1P明显下调CD36、CFD(脂素)、FABP4和LPL(编码脂蛋白脂肪酶)基因的表达。
为了探讨S1P与PPAR-γ之间的功能相互作用，用PPAR-γ激动剂罗格列酮和S1P刺激OB细胞，观察到S1P对Posin、Bglap和OPG的诱导作用被完全消除了，同时罗格列酮消除了SIP抑制了FABP4和CD36的基因表达PPAR-γ是脂肪发生的主要决定因素之一，S1P对PPAR-γ的抑制是否不仅影响成骨细胞的分化，而且影响脂肪细胞的分化。
pPAR-γ是脂肪分化的主要决定因素之一，接下来作者用SIP刺激脂肪前体细胞3T3L1细胞，SIP抑制pparg和PPAR-γ的几个直接转录靶基因Fabp4andLpl的基因表达。
同样地，SIP明显抑制脂肪前体细胞3T3L1的分化，这种抑制作用被JTE-消除。
五、S1P酶缺乏或抑制可减少白色脂肪组织。
体外实验证实了SIP不仅促进了成骨细胞的分化，同时抑制了脂肪细胞的分化。在体内好实验中，Sgpl1flox/floxCre+敲除小鼠的体重和性腺周围白色脂肪组织的重量分别减少了13%和77%，相对体重(性腺/重量)降低了71%。这与体外实验的结果是一致的。
全身磁共振成像(MRI)分析脂肪组织的分布。MRI显示Sgpl1flox/floxCre+小鼠皮下和腹部脂肪体积显著增加。
脂肪细胞大小的组织形态计量学分析Sgpl1flox/floxCre+小鼠呈现较低的平均细胞大小，向较小型细胞显著移位。
Sgpl1flox/floxCre+小鼠小鼠血浆瘦素浓度比对照组低6倍.
食物摄入量和粪便脂肪含量均无差异
同样地，DOP处理的小鼠体重下降20%，性腺周围组织重量减少75%.S1P2基因敲除小鼠表现为骨量减少、血浆OPG降低和肥胖。
S1P2?/?小鼠骨量减少，BV/TV降低45%，Tb.n.降低30%，Tb.Th降低15%。血浆opg浓度降低39%，皮质骨厚度也降低。三点弯曲试验分析，最大载荷降低。
刚度、弹性模量、最大应力是没有变化
S1P2?/?小鼠体重高14%，性腺周重量高70%，相对体重高44%。定量组织形态计量学还显示，S1P2?/?小鼠脂肪细胞体积较大，向大细胞移位。
骨髓脂肪细胞在SIP2?/?小鼠中普遍存在，而在WT小鼠中不存在六、在卵巢切除小鼠模型中，抑制S1P裂解酶，在对骨量保护作用方面与甲状旁腺激素差不多，提高骨强度的作用优于甲状旁腺激素
在卵巢切除小鼠模型中，DOP具有明显的治疗效果：BV/TV高3倍，Tb.N高3.2倍，Tb.Sp.降低32%。这种影响与甲状旁腺激素的效果相当。皮质厚度和骨密度均未改变。
刚度、弹性模量、最大应力均增加DOP在提高刚度和弹性模量方面优于甲状旁腺激素。
测量了血浆前胶原C末端前肽（PICP）的浓度增加。
TRAP染色，DOP对待明显较少破骨细胞，PYD也减少，OPG增加。DOP治疗除对骨量减少有明显的作用外，还能有效地减轻OVX小鼠的体重和体重。S1P与骨骼相关参数的关联
为了更深入地了解SIP与骨的关系，作者收集了个参与者，血清SIP的水平，与骨相关参数的水平。发现血清SIP的水平与骨相关参数有密切的关联。
血清SIP浓度与临床骨形成标志1-n-端前肽（PINP）的浓度呈正相关
血清S1P浓度与钙浓度呈正相关
骨密度与SIP浓度之间的负相关关系
血清S1P浓度甲状旁腺素水平呈负相关
血清S1P浓度与临床Ⅰ型胶原骨吸收标志物c-末端肽无相关性
刚度系数与骨形成标志PINP的血清浓度也呈负相关。S1P浓度随着BMI的增加而增加，其临界值约为30kg/m2，有趣地是，这是肥胖症的临界值，此后随着BMI的进一步增加，S1P浓度逐渐下降。
总结：
文章中，作者从之前的研究中发现SIP可能跟骨稳态有很大的关系，从而构建了SIP裂解酶缺失或抑制的动物模型，结果发现SIP裂解酶缺失或抑制增加了小鼠的骨量和骨强度。FTY（芬戈莫德）是一种S1P类似物，磷酸化后，作用于五种S1P受体中的四种（S1P2受体除外），作者给小鼠注射FTY药物，发现小鼠的骨量和骨强度没有明显的变化，暗示着也许SIP是通过结合SIP2影响骨稳态。SIP裂解酶缺失或抑制小鼠血清的OPG是明显增加的，接下来作者研究了OPG增加的分子机制，发现OPG产生的增加主要通过两个途径，SIP结合SIP2后，通过激活p38-GSK3β-β-catenin和非经典wnt5A-lrp5信号途径诱导OPG。接着，作者构建了OPG敲除小鼠，OPG敲除小鼠呈现严重的骨质疏松，而给予SIP裂解酶特异性抑制剂(DOP)治疗，能够挽救OPG敲除小鼠导致的骨质疏松。间充质干细胞可以分化肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞，作者研究发现，SIP能够结合SIP2，激活成骨分化主要基因表达，抑制脂肪分化基因得的表达。在体内实验中，SIP裂解酶缺失的小鼠脂肪明显减少。证实了抑制SIP裂解酶，能够促进成骨细胞分化，抑制了脂肪细胞的分化。在卵巢切除模型小鼠中，抑制S1P裂解酶，对骨量的保护作用具有与甲状旁腺激素一样效果，抑制S1P裂解酶提高骨强度的作用优于甲状旁腺激素。最后，临床数据显示SIP与临床的骨参数有很大的关联性。这些数据，都表明靶向SIP裂解酶是一种治疗骨质疏松的潜在治疗。
参考文献：
1WeskeS,VaidyaM,ReeseAetal.Targetingsphingosine-1-phosphatelyaseasananabolictherapyforboneloss.NatMed;24:-.
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