接上篇
TRPAisrequiredforhistamine-independent,Mas-relatedGprotein-coupledreceptor-mediateditch
SarahR.Wilson,KristinA.Gerhold,AmberBifolck-Fisher,QinLiu,KushN.Patel,XinzhongDong,andDianaM.Bautista
DepartmentofMolecularandCellBiology,UniversityofCalifornia,Berkeley,Berkeley,CA,USA
TheSolomonH.SnyderDepartmentofNeuroscience,CenterforSensoryBiologyandHoward
HughesMedicalInstitute,JohnsHopkinsUniversity,SchoolofMedicine,Baltimore,MD05,USA
NatNeurosci.0May;4(5):–60.doi:0./nn.
BAM和CQ诱发的神经元兴奋需要TRPA介导接下来探讨TRPA的缺陷是否会改变神经元的CQ和BAM敏感性。与显示BAM反应部分衰减的TRPV缺陷神经元不同(图)，BAM诱导的Ca+信号在TRPA缺陷神经元中被消融(图3A，c)。同样，选择性拮抗剂HC-(HC；00μM)4-6对TRPA的药理抑制显著降低了神经元对BAM的敏感性(图3C；TRPA+/+：6.8±.49；TRPA?/?：0.57±0.36；HC处理：.±0.7)。研究小组还研究了TRPA在CQ诱发的神经元激活中的作用。与野生型神经元(图3B)相比，TRPA缺陷神经元(图3B，c)中CQ诱发的Ca+信号显著减弱。与以前的研究一致，在TRPA缺乏的神经元中，MO诱发的反应也被减弱(图3A，b)。同样，用HC-(HC；00μM)药理抑制TRPA可显著降低神经元对CQ的敏感性(图3C)。尤其重要的是，辣椒素反应细胞在野生型、突变型和HC处理的神经元中的发生率相似(TRPA+/+：5.±5.7%；TRPA?/?：56.7±6.9%；HC处理：55.5±6.%)。图3.TRPA缺陷神经元显示氯喹和BAM8-敏感性丧失（A）从野生型和TRPA缺陷小鼠分离的感觉神经元暴露于BAM8-(BAM；00μM)，然后是异硫氰酸烯丙酯(芥子油：Mo，00μM)和辣椒素(Cap，μM)，用Fura-比色钙成像(代表性反应)检测反应。(B)用氯喹(CQ；μM)、异硫氰酸烯丙酯(芥子油：Mo；00μM)和辣椒素(CapμM)对培养的野生型和TRPA缺陷小鼠的感觉神经元进行暴露，并用Fura-定量钙显像测定反应(代表性反应)。(C)与野生型神经元(黑色)相比，TRPA缺陷神经元(灰色；p0.5；单向方差分析)和HC-处理(HC；00μM；白色)神经元的CQ敏感率显著降低(p0.；单方差分析)。类似地，与野生型(黑色)相比，TRPA缺失(灰色；p0.0；单方差分析)和HC处理(白色，p0.0；单方差分析)的神经元对BAM的敏感性降低。相反，在野生型(黑色)、TRPA缺陷(灰色；p=.73；单方差分析)和HC处理的神经元(白色，p=0.6；单方差分析，n=3个动物，每个基因型n=3个动物；每个基因型n≥个神经元)中，组胺敏感性的患病率是相似的。(D)CQ诱发动作电位放电需要TRPA。典型的电流钳记录显示HC-(HC；00μM)可显著阻断CQ诱发的动作电位相对于车载的放电(CQ：P0.0；单因素方差分析；n≥5细胞/复合体)。BAR值表示S.E.M.。(*p0.05，**p0.0*p0.00)最后，研究小组利用电流钳记录来探讨TRPA在CQ和BAM诱发的神经元兴奋中的作用。在用空白和HC-处理的背根节神经元中，研究小组比较了CQ和BAM诱发的动作电位释电(图3D)。抑制TRPA可明显减弱CQ诱发的动作电位释电(Cq+Vehicle=6.±.；00μMHC-=0.5±0.；p=0.；图3)和BAM诱发的释电(BAM+Vehicle=.3±4.；00μMHC-=.40±0.98；p=0.00；图3)。综上所述，这些结果清楚地表明，功能性TRPA通道是CQ和BAM诱发的神经元兴奋性所必需的。虽然CQ和BAM的信号必须由TRPA介导，但它并不介导所有形式的瘙痒。从TRPA缺乏的动物分离的神经元(图3C)或用HC-(00μM；图3C)处理的神经元表现为正常的组胺诱导反应。这些发现与之前的研究一致，该研究表明感觉神经元5、7、8的组胺信号需要TRPV，而不是TRPA。MRgprA3和MRgprC在功能上偶联到TRPA感觉神经元中的CQ和BAM信号各自需要GPCRsMRgprA3和MRgprC。除了被内源性和外源性刺激物直接激活外，TRPA还是一个受体调节的通道，可以被缓激肽或其他GPCR偶联的炎症介质激活9、30。因此，研究小组提出的问题是，CQ或BAM是否能激活在CQ和BAM不敏感的神经母细胞瘤细胞系NG08中表达的异源TRPA通道。CQ和BAM不能触发Ca+内流到TRPA转染的细胞(图4A)。然而，这些细胞对MO(00TRPAM；图4A)的应用反应强烈，证实了功能μ通道的存在。在单独转染MRGPRA3的NG08细胞中没有观察到CQ诱导的Ca+信号(图4AB)。与我们在TRPV缺失神经元中的发现一致(图)，CQ未能在表达MRGPRA3和TRPV的细胞中触发Ca+信号(图4B)。相反，同时转染TRPA和MRGPRA3的NG08细胞(A/A3)在CQ应用后显示出细胞内钙离子的强烈增加(图4a-b)；这些反应被HC-(00μM；未示出)减弱。因此，MRgprA3和TRPA受体都需要赋予NG08细胞对CQ的敏感性。图4.MRgprA3和MRgprC通过TRPA在神经细胞系中的信号转导。(A)共转染TRPA和MRGPRA3(下)、单独转染MRGPRA3(上)和单独转染TRPA(中)的NG08细胞中，氯喹诱导(CQ；mM)钙反应。应用芥子油(MO；00μM)检测TRPA的表达。Scalebar=0μm(B)单独转染MRGPRA3(左)、TRPV转染TRPV(中)和TRPA(右)转染NG08细胞，氯喹诱发的FURA-比值反应(平均示踪)。Ionomycin(μM)检测结果表明，转染MRGPR3的细胞是健康的，并且负载了FURA-。分别用辣椒素(CapμM)和芥子油(MO；00μM)激活TRPV和TRPA通道。用绿色荧光蛋白(GFP)荧光检测MRgprA3的表达(未显示)。(C)在单独转染MRgprc的NG08细胞(左.58±0.6)、转染TRPV的NG08细胞(中.±0.3)和转染TRPA的NG08细胞(.8±0.3)中，BAM8-诱导的Fura-比值反应(平均示踪)。值显示为峰值±S.E.M。(单独MRgprc与MRgprc+TRPV：P=0.；单独MRgprc与MRgprc+TRPA：P=0.；MRgprc+TRPA与MRgprc+TRPV：P=0.)。分别用辣椒素(CapμM)和芥子油(MO；00μM)激活TRPV和TRPA通道。用绿色荧光蛋白(GFP)荧光检测MRgprC的表达(未显示)。在单独转染MRgprc的NG08细胞中观察到BAM诱导的Ca+信号，但不能观察到单独转染TRPA、TRPV或载体的细胞(图4C)。这将研究组的数据，即MRgprC激活导致钙离子从存储器中释放(图E)，与之前的研究将MRgprC和PLC3联系起来。TRPV与MRgprc共转染引起BAM反应幅度增加(增加30.%；p=.。图4C，中间)。然而，TRPA和MRgprc的共同表达使得细胞内Ca+的增加更加强，比单独使用MRgprc高出8%(p=.；图4C)。这些数据表明TRPV和TRPA都与MRgprC偶联，这些结果与研究小组的发现一致，即这两个通道都有助于BAM诱导的神经元钙反应(图C和图3c)。MRgprA3和MRgprC通过不同的机制与TRPA偶联接下来该小组研究了MrgprA3优先激活TRPA而不是TRPV的机制。由于许多TRP通道是由PLC偶联受体3激活或调制的，并且许多瘙痒原和MRGPR家族成员激活了PLC信号3，所以该小组首先测试了PLC在CQ诱发信号中的作用。PLC抑制剂U73对培养神经元或A/A3NG08细胞(未显示)中CQ诱发的Ca+信号的幅度(图5A)或流变率(图5B)没有影响。先前已经证明，MRgprC的BAM激活是通过PLC3起作用的。与这些发现一致，U73显著降低了培养神经元中BAM诱导的Ca+信号的幅度(图5B)和BAM敏感神经元的流变率(图5C)。同样，U73显著减弱神经元中的组胺信号(图5C)。这些数据表明，虽然BAM和组胺诱导的信号需要PLC信号，但MRgprA3介导的TRPA激活不需要PLC信号。图5.MRGPRA3和MRGPRC利用不同的信号通路激活TRPA(A)氯喹(CQ，mM)诱导的感觉神经元钙信号(有代表性的踪迹)。通过Fura-比色钙成像检测，VeH(左)、G-βγ抑制剂Gallein(中；00μM)或PLC抑制剂U73(右；μM)预处理5min后，TRPA(A)-氯喹(CQ，mM)可激活TRPA(A)-氯喹(CQ，mM)诱导的钙信号(有代表性的痕迹)。(B)BAM8-(BAM8-,00μM)-经VeH、Gβγ抑制剂Gallein(中，00μM)或PLC抑制剂U73(右，μM)预处理5min后，培养的感觉神经元出现钙信号(代表性示踪)，这是Fura-比色钙成像的结果。(C)定量用Vehicle(VEH；黑色)、Gallein(GAL；白色)或U73(U7；灰色)处理后CQ、BAM和His敏感神经元的百分比。(D)Gallein抑制氯喹诱发的动作电位放电。典型的电流钳记录显示，Gallein(00μM)可阻断CQ诱发的动作电位放电。所有bar值代表S.E.M.。(*p0.00，**p0.0*p0.05；单因素方差分析)GPCR信号导致G-α和G-βγ亚基的解离。此外，G-βγ信号已被证明可以直接开放离子通道33。因此，研究小组需验证在MRgprA3诱导的TRPA的激活过程中是否需要Gβγ信号？神经细胞用Gβγ的小分子抑制剂Gallein预处理后，CQ诱发的钙信号的幅度和CQ敏感细胞的数量都大大减少(图5A)，7.6±.%；没食子酚：4.6±.%；图5C)。没食子酚不直接作用于TRPA，因为芥子油诱导的TRPA的激活不会被该抑制剂改变(未显示)。同样，没食子酚蛋白对神经元中组胺诱发的信号没有影响(图5C)。我们还用电流钳记录的方法探讨了G-βγ在CQ诱发的神经元兴奋中的作用。没食子酚显著减弱CQ引起的膜去极化和动作电位放电(载体：7.00±3.4；00μM没食子酚：.33±.53；图5d)。最后，我们探讨了G-βγ在异种细胞中MRgprA3和TRPA偶联中的作用。共表达G-βγ螯合肽34或用大帆船处理可显著减弱NG08细胞的CQ反应(图5e；对照=8.34±9.6；光导蛋白=58.±.6；p=0.；数据未示出)。在NG08细胞中，共表达PdC或用Gallein处理可显著减弱CQ反应(图5e；对照=8.34±9.6；光导蛋白=58.±.6；p=0.；数据未显示)。这些实验表明，MRgprA3与TRPA的偶联需要G-βγ信号。Gβγ信号也已被证明通过PLC35、36打开信号通道。因此，接下来的问题是，TRPA和MRgprC之间依赖于PLC的耦合是否也需要Gβγ信号？没食子酚预处理对BAM诱发的Ca+信号的幅度(图5B)或BAM敏感细胞的比例(图5C；空白(VEH)：7.06±.94%；U73(U7)：0.98±0.95%；没食子酚(GAL)：6.54±3.46%)没有显著影响。同样，在TRPA/MRgprcNG08细胞中过表达PDC并不能减弱BAM诱导的反应(图5e，对照=8..55；光诱导蛋白=8.95±6.；p=0.)。这些实验提供了证据，证明PLC通过GαQ信号是MRgprC引起的神经元激活所必需的，并可能解释为什么MRgprC可以与TRPA和TRPV偶联，类似于缓激肽受体9、9。CQ和BAM诱发的瘙痒需要TRPA鉴于在CQ和BAM的细胞活动中需要TRPA，那么TRPA缺陷的小鼠在CQ和BAM引起的瘙痒中是否也表现出行为缺陷？研究小组检查了颈背注射这些瘙痒原后的搔抓情况。CQ和BAM在野生型小鼠中引起强烈的搔抓行为(图6A)。在TRPA缺陷的窝产仔中，搔抓所花费的时间显着减少(图6A)，达到与空白注射相似的水平(图6A)。相反，无论是CQ还是BAM注射，野生型小鼠和TRPV缺陷的窝产仔之间都没有观察到差异(图6A)。这些结果表明，虽然TRPV部分参与了培养细胞对BAM的反应，但TRPV缺陷神经元中残留的BAM敏感性驱动了BAM诱发的瘙痒行为，并需要功能正常的TRPA通道。缺陷小鼠对氯喹和BAM8-不敏感(A)颈背部皮下注射氯喹(CQ，00mg/50μl，8mm)或BAM8-(60μg/0μl，3.5mm)，观察野生型(WT；黑色)、TRPV缺陷(VTRPA；灰色)和TRPA缺陷(ATRPA；红色)小鼠瘙痒诱导的抓挠行为。结果表明，皮下注射氯喹(CQ，00mg/50μl，8mm)或BAM8(60μg/0μl，3.5mm)可引起瘙痒。注射后0分钟计算抓挠所花费的总时间(p0.0；单因素方差分析)。注射赋形剂(PbS，50μL)可引起野生型小鼠(VEH；白色)的一些抓挠反应。(B)在面颊瘙痒模型中，向面颊皮下注射瘙痒原(氯喹，00μg/0μL，40mm)可引起用后掌抓挠脸颊(左)。相反，注射刺激性的芥子油(MO，mm)，则需要用其中一个前肢(右)擦拭。(C)在野生型(WT；黑色)、TRPV?/?(V?/?；灰色)和TRPA?/?(A?/?；红色)小鼠脸颊注射CQ(00μg/0μL，40mm)或BAM8-(60μg/0μl，3.5mm)，观察其瘙痒反应。注射后0分钟，量化抓挠所花费的总时间。注射赋形剂(0μL)不能引起划痕或擦拭(VEH；白色；p0.0；单向方差分析)。所有BAR值代表S.E.M.。
为了区分CQ和BAM引起的瘙痒和疼痛行为，研究小组使用了瘙痒的“脸颊”模型，其中刺激物被注射到脸颊，而不是颈部37。注射CQ或BAM会引起后肢对脸颊的强烈抓挠(图6b-c；补充视频)。相反，注射刺激性物质，如芥子油(毫米)，则需要用其中一个前肢擦拭脸颊(图6B)。标准的擦拭动作通常是用两个前肢摩擦头部或面部(未示出)。注射CQ或BAM后未观察到擦拭现象。因此，我们使用这个模型来更好地研究TRPA在CQ和BAM引起的瘙痒中的活体上的作用。通过面颊试验，CQ和BAM在野生型小鼠中引起较长时间的抓挠。TRPA+/+小鼠与TRPV+/+小鼠之间无显著性差异(BAm：A-Wt=49.s；V-Wt=50.5s；p=0.9；单因素方差分析；CQ：A-Wt=s；V-Wt=04.8s；p=0.94；单因素方差分析)，从而合并了这些动物的数据(图6C)。同样，在野生型和TRPV缺陷小鼠之间，没有观察到BAM或CQ引起的搔抓有显著差异(图6C)。相反，在TRPA缺陷小鼠中从未观察到这种搔抓行为(图6C)。TRPA基因缺陷小鼠一般不能抓挠或对所有瘙痒原不敏感，因为面颊注射α-甲基5-羟色胺(μM)可引起强烈的搔抓反应(WT=48.3±0.8s；TRPA?/?=5.0±0.4s；p=0.87；n=/基因型)。这些实验表明，TRPA对于CQ和BAM诱发的瘙痒都是必需的。
DISCUSSION讨论瘙痒既由组胺依赖途径介导，也由独立途径介导。与皮肤和全身疾病相关的慢性瘙痒对抗组胺药物治疗不敏感，甚至过敏性瘙痒也只能被组胺受体拮抗剂38轻微抑制。然而，人们对组胺非依赖性瘙痒的机制知之甚少。GPCRsmrgprA3和mrgprC分别是CQ和BAM8-的受体，这两种致痒原能诱导强烈的抗组胺不敏感的CHIC6，39。研究小组的结果清楚地表明TRPA在MRgprA3和MRgprC下游都可被激活，并且是介导CQ和BAM诱发的信号和瘙痒行为的主要转导通道。大多数MRGPR是孤儿受体GPCR，其潜在的信号转导机制在很大程度上是未知的。然而，MRgprC已被证明与GαQ/途径偶联，并激活异种细胞3中的PLC。与这些发现相一致的是，研究小组证明了MrgprC诱发的兴奋需要神经元中有功能的PLC信号。大多数Trp通道都是由PLC激活或调制的，这使得它们很可能是MRgprC的下游靶标。事实上，MRgprC阳性的BAM敏感神经元同时表达TRPA和TRPV。因此，BAM自然可同时激活异种细胞中的TRPA和TRPV，或者这两个通道都对BAM引起的神经元钙信号起作用。然而，令人惊讶的是，BAM诱发的瘙痒行为需要TRPA，而不是TRPV。这一发现类似于缓激肽诱导的信号，PLC的活化作用能强烈地激活TRPA，仅能轻微激活TPRV以促进钙内流；由于钙也可激活TRPA40，4，因此钙通过TRPV的渗透打开了额外的TRPA通道，最终导致机械和热敏感。与BAM相似，在体外，TRPV或TRPA的缺失会导致缓激性钙信号的减弱，但只有TRPA的丢失才会导致炎症行为反应的减弱。因此，TRPA在体内的缓激肽和BAM信号转导中起主导作用。与BAM不同的是，药物抑制PLC不会改变感觉神经元或转染细胞系中CQ诱导的TRPA激活。这些发现与以前的研究结果一致，即CQ诱发的瘙痒在缺乏PLCTRPV5的小鼠中是正常的。此外，CQ诱发的信号不需要神经元中有功能的β通道，并且在异种细胞中MRgprA3不能与TRPV偶联。是什么信号通路介导了MRgprA3与TRPA的功能偶联，而不是TRPV的功能偶联呢？
在躯体感觉中，G-βγ是吗啡镇痛所必需的，它直接激活背根节神经元4、43的N-型和P/Q型钙通道。在这里，研究小组表明Gβγ可能是另一种能够调节色氨酸通道活性的信号分子。G-βγ的小分子抑制剂没食子酚和G-βγ螯合肽特异性地减弱CQ诱发的信号，而对组胺或BAM信号无影响。综上所述，这些数据表明Gβγ可能是介导MRgprA3和TRPA特异性偶联的候选基因。Gβγ通过直接结合调节几个离子通道，包括G蛋白偶联的内向整流钾通道和电压门控钙通道家族的成员33。未来的研究将阐明Gβγ是直接开放TRPA通道，还是通过另一种信号中间途径开放TRPA通道。该发现还支持这样的假设，即色氨酸通道是疼痛和瘙痒的关键介质。先前的研究表明，TRPV是组胺引起的瘙痒5，8的主要转导分子。然而，只有一小部分TRPV阳性神经元表达组胺受体并转导瘙痒。同样，只有TRPA阳性神经元的子集共表达MRgprA3并对CQ有反应，而这些细胞中甚至更小的子集也表现出对MRgprC和BAM有反应。转导BAM和CQ瘙痒信号的TRPA阳性神经元的分子亚群支持瘙痒的标记线理论，即不同的致痒原使用一条专门的通路来转导瘙痒信号。相反，TRPA被确认为瘙痒和疼痛的关键转导也支持瘙痒的空间对比理论，即瘙痒是由感受野内少量疼痛纤维的激活触发的，而疼痛是当更多的细胞被激活44时启动的。与TRPA和TRPV一样，MRgprC被认为不仅在瘙痒中起作用，而且在过敏症45中也起作用。此外，有几项研究描述了疼痛的化学或机械刺激对瘙痒的抑制作用、46、47。对这两种瘙痒理论的有力支持促进了一种改善型的“选择性”的瘙痒理论，该理论融合了两种瘙痒模型的各个方面。最近发现的瘙痒特异性脊髓神经元表明，中央回路可能产生瘙痒信号47、48中观察到的特异性。然而，瘙痒和疼痛之间的关系仍然是躯体感觉中一个紧迫的问题。了解瘙痒和疼痛的分子机制是了解这种复杂关系的第一步。研究小组的结果揭示了TRPA在CQ引起的瘙痒中的新作用。MRGPRA3激动剂和抗疟疾药物CQ的一个主要副作用是无法忍受的瘙痒。CQ价格便宜，易于管理，在治疗和预防疟疾方面都非常有效。事实上，对CQ的需求正在上升，因为最近的研究表明抗CQ的恶性疟原虫已有所减少49。然而，CQ引起的瘙痒在深肤色的非洲人中尤其普遍(高达70%)，是依从性差或治疗失误的主要原因。对CQ的瘙痒反应的差异可能是由于MRGPR信号通路或TRPA的多态性不同造成的，就像家族发作性疼痛综合征，最近与TRPA50功能突变的获得有关。在这种情况下，采用抑制MRgprA3或TRPA的改进疗法旨在减轻氯喹引起的瘙痒，可能使CQ在非洲仍然是一种有效和相关的治疗方法。除了CQ，慢性瘙痒还源于皮肤病和全身疾病，如湿疹、肝硬化和一些癌症、糖尿病，以及包括多发性硬化症、带状疱疹后神经痛及有可能最普遍的过敏性炎症在内的神经疾病。肥大细胞-神经元的相互作用在所有这些瘙痒情况下都起着关键作用。肥大细胞与周围神经密切相关，释放多种作用于感觉神经元的瘙痒因子。MRgprA4和MRgprC都被神经肽FF激活，FF是一种在变态反应诱导的肥大细胞脱颗粒过程中从肥大细胞释放的瘙痒原。这些发现表明，内源性瘙痒原是针对MRgpr家族成员的，并证明了MRgprC和TRPA在过敏性肥大细胞介导的炎症中起着重要作用。或许，最重要的还有，该研究结果表明，TRPA是一个下游转导通道，多个组胺非依赖性瘙痒通路汇聚到该通道上。BAM和CQ通过两条不同的信号通路激活TRPA。上述行为研究表明，TRPA缺乏的动物对这两种瘙痒原的反应明显丧失了瘙痒诱发行为。因此，TRPA拮抗剂可能对选择性减弱抗组胺不敏感的瘙痒有用，这是一个与病理性瘙痒状况特别相关的问题。目前尚不清楚MRgprA3、MRgprC和TRPA信号是否与慢性瘙痒有关。MRGPR和TRPA缺陷小鼠现在提供了一种基因模型，用来评估顽固性瘙痒的机制。实验方法和步骤神经细胞培养在所有实验中，从P0-P4小鼠幼鼠中分离出三叉神经节或背根神经节神经元。然而，所有的结果也得到了成年小鼠神经元培养的证实。神经元的制备和比率钙成像如前所述9进行。分离感觉神经节神经元，在含.4mg/ml胶原酶P(Roche)的Hanks无钙平衡盐液中孵育0min。神经元在0.5%标准胰蛋白酶、Versene-EDTA溶液(STV)中温和搅拌孵育3min。细胞经洗涤、研磨后接种于培养基(MEMEagle‘sEagle’sWithEarle‘sBSS培养基，添加0%马血清、MEM维生素、青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺)。将神经元电镀到玻璃片上，在0小时内使用。所有培养基和细胞培养补充剂均购自加州大学旧金山分校细胞培养设施。NG08细胞培养NG08细胞在包覆多聚D-赖氨酸的载玻片(Nalgene-Nuc)上培养。用50ng的人TRPA、50ng的人TRPV、ng的人HRH、ng的小鼠MRgprc和/或ng的小鼠Mgrpr3质粒，用脂质体(Invitgen)转染细胞。转染6小时后，将细胞复制到玻片上进行钙显像。钙质成像钙显像实验中，细胞在含有40NaCl、5KCl、0HEPES、CaCl、MgCl、0D(+)-葡萄糖、pH7.4的生理林格液中，加入0μMFura-AM(Invitgen)、0.0%PluronicF-7(Invitgen)，负载h。所有化学品均从西格玛购买。采集的图像以nm与nm的比例显示，并用Metamorph软件对齐。每次实验结束时，用高钾溶液(75MM)诱导去极化，鉴定细胞为神经元。如果在使用激动剂后的0s内，神经元对激动剂的平均比率高于基线的≥5%，则认为神经元对激动剂敏感。使用Matlab和IgorPro(WaveMetrics)中的自定义例程执行图像分析和统计。用单因素方差分析(ANOVA)评估统计学意义，然后是Tukey‘sHSD。所有显示Fura-比率的图形都已归一化为基线比率：比率F/F=(比率)/(比率=0)。电生理学用如上所述的钙成像评估原代小鼠背根神经节神经元对CQ和BAM的敏感性。选择在CQ(MM)或BAM(00μM)作用5秒后FURA-比率变化5%的细胞进行全细胞电流钳记录。电流钳记录如前所述(Fujita等人，年)。电极电阻在-6MΩ之间。内液含量(Mm)：40mMKCl，5mMEGTA，0mMHEPES(用KOHpH7.4)。在密封形成之前，移液管电位被抵消。液结电位5mV，未校正。实验只在串联电阻在30MΩ以下的电池上进行。静息膜电位平均为?55±8.mV，放电阈值为?44.5±7.0mV。数据以5kHz采集，kHz过滤(Axopatch00B，PCLAMP软件)。实验鼠及其行为测试将小鼠(0-35g)置于°C的小时光暗循环中，观察小鼠的瘙痒行为。小鼠面部(0μL)或颈部(50μL)皮下注射三种溶液：)无钙镁缓冲盐水；)0μg氯喹溶解于磷酸盐缓冲液；3)00μg氯喹溶解于磷酸盐缓冲液。注射后对小鼠进行5分钟的录像。在0分钟的时间内，每只鼠标花在抓挠上的时间和抓挠的次数都被量化了。一轮抓挠被定义为老鼠抬起爪子，连续抓挠任意时间，直到爪子回到地板上的插曲。行为评分是在对基因型和注射的溶液盲的情况下进行的。所有实验都是在国际疼痛研究协会的*策和建议下进行的，并得到了加州大学伯克利分校动物护理和使用委员会的批准。PCR从单个感觉神经元中提取RNA。先用钙显像法检测细胞对氯喹或BAM8-的敏感性，将每组3~4个细胞抽吸入装有裂解缓冲液(50mMTris-Cl，pH8.3，75mMKCl，3mMMgCl，5U?-RNasin(Promega))的大直径玻璃电极中闪速冷冻。以小鼠Moloney白血病病*和禽类逆转录酶为模板，37°C逆转录h，扩增产物稀释为:0，以此为模板进行PCR实验。PCR引物为：TRPA5–GATGCCTTCAGCACCCCATTGCTTTCCTTAATC–35–CTAAAAGTCCGGGTGGCTAATAGAACA–3MrgC5–GCCTCTTGGGCTTTACTTGTT–35–GGGACCTATGCTTTCTATGCTG–3MrgA35–CGACAATGACACCCACAACAA–35–GGAAGCCAAGGAGCCAGAAC–3GAPDH5–CCATGACAACTTTGGCATTG–35–CCTGCTTCACCACCTTCTTG–3.统计分析值报告为平均值±S.E.M。为了在两组之间进行比较，使用了单方差分析，然后进行了土耳其-克雷默后测。为了分析多个测量中两个或更多组之间的变量，使用了双向方差分析。补充资料见NCBI补充资料致谢这项研究得到了美国国立卫生研究院创新者奖、皮尤学者计划和麦克奈特学者的支持、基金(DB)、NSF(SW)和NIH对XD的资助。感谢MarionKollarik博士对PCR的建议，RachelBrem博士使用设备，TakeshiMorita博士提供技术支持，Brem博士、Ngai博士、Sack博士、Tsunozaki博士、ArYAL博士和Pellegrino博士对手稿进行了有益的讨论和批判性阅读。
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