期刊信息
介绍
文章主图4幅，补充图16幅。
主要内容
多发性硬化症（MS）–一种中枢神经系统的自身免疫性疾病–会增加血液中的转录多样性，Tfh细胞在中枢神经系统中局部驱动B细胞反应，Tfh细胞促进B细胞向CNS的浸润并促进MS样自身免疫。
亮点
将单细胞转录组学应用于MS和对照患者的血液和CSF细胞，并验证关键发现。
1.确定了脑脊液（CSF）的细胞成分和转录组，包括CSF中未知的髓样树突状细胞（mDC）富集。
2.发现MS主要影响CSF的细胞组成，但影响血液中细胞的转录表型。
3.开发了一种名为细胞集富集分析（CSEA）的方法，从而观察B细胞、滤泡辅助T细胞（Tfh）的扩增。证实了在两种不同的MS动物模型中，此类Tfh细胞可促进CNS自身免疫和局部B细胞浸润。
脑脊液（CSF）
中枢神经系统（CNS）
多发性硬化症（MS）
滤泡辅助性T细胞(Tfh)
细胞集富集分析（CSEA）
特发性颅内高压（IIH）
外周血单核细胞（PBMC）
差异表达的基因（DE）
方法
收集血液和脑脊液样本-分离细胞-10XGenomics上机测序-质控-归一化-分群（挑）-差异基因筛选（圈）-功能富集（联）-细胞相互作用（靠）
思路
首先，脑脊液和血液中细胞的单细胞结果分群，将脑脊液和血液的61,个单细胞分为17个细胞亚群；其次，进一步介绍CSF与血液相比的亚群细胞类型组成，亚群细胞基因表达差异；然后，介绍MS患者血液和CSF细胞亚群组成、基因表达的变化；进一步对MS患者CSF中的CD4+T细胞群聚类，分析CD4+T细胞亚群的变化；使用CSEA细胞富集分析发现CD4表达Th1和Tfh样特征的T细胞在MS中富集于脑脊液，推测Tfh细胞促进B细胞浸润；进一步使用动物实验验证Tfh亚群在MS的CSF中扩增并加剧自身免疫性脑脊髓炎(EAE)（1）首先，使用髓鞘少突胶质糖蛋白(MOG35-55)诱导CD4CreBcl6fl/fl小鼠自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，发现Tfh细胞细胞缺乏，会导致MOG35-55诱导的EAE减轻；（2）其次，CD4CreBcl6fl/fl小鼠中，Bcl6缺乏的Pan-T细胞会影响EAE靶向Tfh细胞和滤泡T调节细胞（TFR）启动阶段。进一步使用2D2tgCD4CreBcl6fl/fl小鼠，排除干扰，结论同上一致。说明Tfh细胞在中枢神经系统中局部驱动B细胞反应，并促进MS样自身免疫。结果
1.脑脊液和血液中细胞的单细胞转录组学设计思路如图1a，使用10XGenomics，获得了总共42,个血液单细胞转录组（五个对照vs.五个MS供体）和22,个对应的CSF单细胞转录组（四个对照vs.四个MS供体）。去除红细胞和劣质细胞群后，将61,个单细胞分为17个细胞亚群（图1b）。图1c描绘了CSF与血液的中细胞群的丰度倍数变化的差异（比较有意思的细胞火山图）。1.αβT细胞(CD3E,LCK,TRAC,andTRAJ16)
2.CD4+T细胞（IL7R和CD4）3.活化的CD8+T细胞（CD8A;CD8b的和CCL5）4.未活化的CD8+T细胞（CD8na;CD8b的和CCR7）5-6.调节性T细胞（FOXP3和CTLA4）和一小群γδT细胞（TRDC）7-8.两个自然杀伤（NK）细胞群（GNLY和NKG7）最有可能代表的CD56dim(NK1;FCGR3A/CD16andPRF1),naiveCD56bright(NK2;SELL/CD62LandXCL1)9-11.三个B细胞亚群（CD74，CD79A和IGH基因家族）分别对应于naiveBcells（B1;CD37和IGHD），活化B细胞（B2;CD27和IGHM）和浆母细胞（血浆;IGHG，CD38和TNFRSF17/CD;对于MS4A1/CD20和SDC1/CD为负）12-13.髓细胞（LYZ）分离成mDC的1型（MDC1;WDFY4，XCR1，和BATF3），mDC的2型（MDC2;FCER1A，CD1C，和CLEC10A），和granulocytes(granulo;SA8andSA9)14-15.另外两个单核细胞群主要是血液来源的（Mono1;FCGR3A/CD16）或CSF来源的（Mono2;CD14）16-17.其他群代表浆细胞样树突状细胞（pDC;TCF4/E2-2和TNFRSF21/DR6）和巨核细胞（MegaK；GNG11和CLU）图1：单细胞转录组学可重建CSF和血液的特异性白细胞亚群组成pDC，浆细胞样树突状细胞（DC）；mDC1，髓样DC1型；Mono1，单核细胞群1优先来自血液；Mono2，主要来自CSF单核细胞群2；gran，粒细胞；Tdg，γδT细胞；CD8na，未激活的CD8+T细胞；CD8a，活化的CD8+T细胞；Tregs，调节性CD4+T细胞；CD4，CD4+T细胞；NK，自然杀伤细胞；MegaK，巨核细胞；B1/B2，B细胞亚群；plasma，成浆细胞。2.脑脊液白细胞表现出特定的组成和转录组特征CSF与血液相比的亚群特异性细胞类型组成CSF相比血液非造血细胞（例如，神经元，神经胶质，和室管膜细胞），巨核细胞，粒细胞和红细胞（从最终的聚类移除）缺失或大大减少（图1D，E，补充图3a，b）。CSF细胞中CD56dimNK1细胞减少，而NK2群没有差异（图1D，E）。mDC1和mDC2群在脑脊液中的比例均显著高于血液中的比例（图1d，e）。值得注意的是，MDC1细胞中表达的指示交叉呈递能力（标记XCR1和WDFY4图1C）。在T细胞中，脑脊液中的CD4细胞总数和Treg含量更高，而CD8T细胞群没有差异（图1d，e）。流式细胞仪证实了这种独特的CSF的白细胞组成（补充图4a–c）。scRNA-seq或流式证实，CSF和血液中的细胞比例均不相关。证实了CSF细胞具有高度的亚群特异性，并确定了CDC中mDC1和Treg的富集。髓细胞的脑脊液特异性模式Mono2群几乎完全是CSF衍生的（图1d，补充图2c），并且规范标记显示了中间CD14+FCGR3A/CD16int表型（图1c）表达了独特的转录特征，包括先前在经典（CD9，CD，EGR1和BTG2）和非经典（C1QA，C1QB，MAF和CSF1R/CD）单核细胞中鉴定的基因。源自CSF的Mono2群还表达（补充数据集1）血管周巨噬细胞（LYVE1），小胶质细胞（TREM2，TMEM和GPR34）和中枢神经系统边界相关巨噬细胞（STAB1）和CH25H标志物。Mono2基因特征类似于先前描述的稳态小胶质细胞（补充图14a-d）。细胞群的基因表达特征每个细胞群上识别其他特定于群的基因表达特征（补充表5）。三种方法：Mann–WhitneyU+edgeR+scVI，三重一致的基因是脑脊液中的差异基因（DE）在多个CSF群中诱导的基因包括FGF9，先前与发炎的CNS组织损伤和金属硫蛋白E有关，可能与CSF金属离子稳态相关。细胞周期（例如，CCNC/细胞周期蛋白C）基因在诱导CD4+T细胞在CSF符合他们的活化的表型。脑脊液CD4+T细胞中诱导的基因还与脂质抗原识别（CD1E），与抗原呈递细胞的相互作用（CD81，CD83，CD84和CD）以及黏附和迁移（CD99）相关。CSFT细胞表达特定的趋化因子和整联蛋白转录物模式，包括CXCL16和CXCR5的诱导，CSFCD4+T细胞中ITGAL/VLA4的下调以及骨髓细胞中ITGB7的下调（补充图3c，补充数据集2）。在CSFT细胞中始终下调的基因与幼稚的细胞状态（SELL/CD62L）和细胞因子应答（IL2RG/共同的γ链）相关。先前与细菌CSF易位相关的CD48在CSFT细胞中被上调（补充数据集2）。GSEA在CSF诱导的基因中显示出富集的病原体应答途径（例如KEGG途径hsa69和hsa68；补充数据集3）。B细胞群（B1，B2和血浆）在各亚群之间没有转录变化（补充数据集2）。与记忆形成相关的基因（ID3和CCR2）在CD8a群中被诱导（补充数据集2）。单细胞转录组学鉴定了CSF中白细胞的位置特异性转录表型和运输分子表达。3.MS血液和CSF细胞组成的转录表达的变化细胞组成的变化流式细胞证实（补充图4b，c），与对照相比，血细胞在MS中在组成上没有表现出显著差异（补充图5a，b）。血细胞表现出多种“三重一致”的转录变化（补充数据集4），在T细胞中，包括激活标记（ICOS），特异性细胞因子受体（IL17RA）和运输分子（PECAM1/CD31,ITGA5/α5整合素）的诱导。（补充图5c）。MS患者与对照组相比，CSF的细胞类型组成明显不同（图2a，b）。根据流式细胞术（图2a，b），与对照组相比，MS中的所有B谱系细胞群（B1，B2和血浆）在CSF中均显著增加（补充图4b，c）。成熟的B细胞群（B2和血浆）中的重链基因表达主要由IGHG/IgG基因控制（补充图6a–d）。由于成熟过程中血液中的重链使用从IGHD演变为IGHM到IGHG/IGHA，因此CSF中的大多数B细胞进行了转换。IGKC/κ与IGLC/λ之比在脑脊液中为2.75，在血液中为1.92。与已发表注释基因集（见方法说明）进一步比较证实了B细胞群，并提示血浆群中有一些生发中心和成浆细胞表型细胞（补充图6e，f）。通过流式细胞（补充图4b，c）和scRNA-seq（图2a，b）证实，与对照组相比，MS中CSF中的CD56dimNK1和CD56briNK2细胞群以及CD8na群均增加（图2a，b）。发现MS中CSF中mDC1细胞和Treg的增加，而γδT细胞（Tdg）则明显减少（图2a，b）。MS诱导了CSF白细胞组成的复杂变化，其特征是细胞类型同时扩展，具有产生抗体的能力（B1，B2和成浆细胞），细胞*性（CD8na和CD56dimNK1），并且具有调节潜力（Tregs和CD56briNK2）。图2：MS主要改变CSF细胞组成和血细胞转录表达CSF细胞群中与疾病相关的“三重一致”的转录变化1.在CSFT细胞中，发现了与免疫激活（HLA-C和CD5）和干扰素反应（IL12RB1和IL18RAP）及相关下游信号分子（IRF3和IRF8;图2c）相关的基因的诱导。2.MS中上调了特定的运输分子（例如ITGB1/integrin-β1）。3.CD8a群显示出记忆细胞形成增加的迹象（ID3）。4.Treg群显示出转录因子STAT1的诱导以及一些干扰素调节的基因（MUM1和NUCB2）。5.mDC2群诱导了B细胞相关基因（例如CD79A和CD74）以及IL-2信号转导的信号（STAT5A）和共抑制分子（TNFRSF18/GITR）。6.B细胞群可能不会显示差异表达的基因（补充数据集5），这表明MS优先诱导CSF中B细胞的类型差异而不是表型差异。直接比较MS脑脊液和血液的作用时，血液中差异表达的基因比例要大于脑脊液。CSF中与MS相关的细胞反应是多样的和亚群特异性，并表现出干扰素调节反应的迹象（补充数据集5）。在血液中，MS优先增加转录多样性，而在CSF中，MS优先增加细胞类型多样性，提示MS特异性疾病机制。4.MS中CSF的细胞*性T辅助细胞增加作者直接聚焦到CD4+T细胞群CD4+T细胞群聚类对CD4+T细胞群进行了子聚类（图3a，补充图7a–c，补充数据集6）。CD4+T中保留了少数CD8T细胞群（CD8B；CD4+T细胞亚群（CD4Tc）＃8；所有CD4+T细胞的7.54％）（图3a，b）。CD4+T细胞大致分为naive-like（SELL和CCR7;CD4Tc＃5,11,1,2）和memory-like群（CD44;基于标记基因表达的CD4Tc＃9,4,0,3,6,7）（图3b）。记忆细胞进一步分为亚型，大部分具有效应记忆样（CD69；CD4Tc＃3,0,4）和中央记忆样（CD27；CD4Tc＃7,6,9）表型。确定了一个可能的Treg群（FOXP3和CTLA4；CD4Tc＃10，图3b）位于幼稚细胞和记忆细胞之间的交叉处（图3a）。该群还表达了肿瘤微环境中Tregs抑制能力丧失有关的T细胞衰竭的单独标志物（TIGIT；补充图7f）。图3：在MS的CSF中诱导出CD4+T细胞的细胞*性样种群使用VISION（以前称为FastProject41）来识别基因集，而不是单个标记基因来更好地解释CD4+T细胞亚群。基因集鉴定了从原始到记忆T细胞状态的转录梯度（补充图7d）。并且可能表明CD4+T细胞通常形成转录梯度，而不是形成独特的亚群，这也解释了单独的聚类方法对这种细胞类型的适用性较差。CD4+T细胞亚群的变化与血液相比，脑脊液中有几个记忆样群（CD4Tc＃3,4,0,9）更为富集，而naive群（CD4Tc＃1,11,2）和exhaustedTregs群（CD4Tc＃10）的频率较低。与对照组相比，与疾病相关的血液变化仅限于MS中单个记忆样群（CD4Tc＃4）的减少（补充图7e）。在血液和CSF的转录变化并不包含任何的TH细胞的转录物（例如，TBX21，GATA3，和RORC;补充数据集7，8）。在CSF中，MS中的记忆细胞的CD4+T细胞亚群（个细胞）相对于对照显著富集（CD4Tc＃0；图3d）。尽管相似水平的CD4+T细胞标记基因（CD4和IL7R），该群表达了与细胞*性功能相关的多个基因（GZMB，PRF1和CCL5），并且该人群中没有CD8或NK细胞标记（CD8B和NKG7；图3e）。该基因标记显示出与最近描述的细胞*性CD4+T细胞群相似性，该群体富集在最近激活的CD4+T细胞效应记忆（TEMRA）亚群中。量化了CD4+CD45RA+CD27-TEMRA细胞和CD4+CD25高CD低在新招募的供体的脑脊液中通过流式细胞术测定Tregs（补充图8）。MS中的两个种群均比对照中的种群明显富集（图3f，g）。这表明细胞*性CD4+T细胞和Tregs在MS的CSF中扩增。5.CSEA识别不依赖群的转录变化开发CSEA聚类分析不容易鉴定Th细胞亚群，作者开发了CSEA，该程序可重复使用GSEA测试来处理排名的细胞列表而不是基因（方法，补充图7）。在该程序中，首先按照目标转录表型对细胞进行排序（例如，途径中基因的总表达）。然后，统计测试可以检测出其中一组（例如，MS）的细胞子集与第二组（例如，对照）的细胞相比，表现出该转录表型异常高或低的情况。作者将这种分析与从VISION流程获得的特征分数一起使用，该分数基于从数据库和文献获得特征来专门分析CSF和血液中的CD4+T细胞。CSEA表明MS富含并表达某些基因特征的细胞（补充数据集9）与对照相比，MS富含的细胞组表达Th细胞类型1（Th1）和Tfh细胞（补充图9b，c）。发现Tfh基因富集于脑脊液（p?=0.），而不是血液（p?=0.）。Th1细胞在血液（p?=0.）和CSF（p?=0.0）。前缘大小反映了驱动高富集分数（ES）的细胞数量。在所有情况下，前沿都很小（个细胞；补充数据集9），表明细胞的一个子集正在驱动富集。生成了一个随机基因集，该基因集与原始签名集在基因数量和每个基因的平均表达上都匹配。基因集的ES高于随机基因集的ES。通过更宽松的平均表达匹配也获得了相似的结果（补充图13）。CD4表达Th1和Tfh样特征的T细胞在MS中富集于脑脊液，但分布在亚群中。Tfh细胞是B细胞成熟所必需的。假设Tfh可能与CSF中MS特异的B细胞扩增在功能上相关。6.Tfh子集在MS的CSF中扩展并加剧EAEMS中CSF中Tfh细胞是否实际上发生了改变流式细胞在CSF中鉴定出CD3+CD4+CXCR5+Tfh细胞，MS患者中Tfh细胞的比例显著增加（图4a，b）。CSF中活化的PD-1+和PD-1+ICOS+Tfh细胞也增加（图4b），而替代CD4+CXCR5-PD-1+亚群50不变（补充图12d）。CSF中PD-1+Tfh细胞的百分比与通过流式细胞仪定量的CSF浆细胞的比例呈正相关（r?=0.70，p?0.05）。MS患者（n?=7）与对照（n?=6）的CSF中分选出的Tfh细胞进行了大批量RNA测序，没有基因达到差异表达的显著性阈值（补充图12c，补充数据集10）。表明CSF驻留的Tfh细胞的丰度增加，但在MS中并未显著改变其表型。GSEA发现了MS衍生的Tfh细胞中与T细胞记忆和致病性相关的基因集（不是单个基因）的富集（p?0.01，Bonferroni校正；补充数据集10）。基因在这些富集基因组重复（补充图11）与细胞*性（例如，GZMA，GZMK，CASP3，和CASP4）和共抑制功能（例如，KLRG1，TIGIT，和CTLA4）相关联。致病性Tfh细胞可能在MS患者的CSF中扩增。图4：Tfh细胞在MS的CSF中扩增并促进MS动物模型髓鞘少突胶质糖蛋白(MOG35-55)诱导CD4CreBcl6fl/fl小鼠自身免疫性脑脊髓炎(EAE)CD4CreBcl6fl/fl小鼠缺乏Tfh细胞，无法引起抗原特异性B细胞应答，而其他Th细胞谱系的分化（补充图10A）和免疫后外周免疫亚群的组成均未改变（补充图10B）。髓鞘少突胶质糖蛋白(MOG35-55)诱导CD4CreBcl6fl/fl小鼠自身免疫性脑脊髓炎(EAE)与Cre阴性对照相比，炎症程度降低（图4C）。CD4CreBcl6fl/fl小鼠的脊髓中炎性病变的数目和浸润区域的数量低于对照组（补充图10c，d）。分析Tfh细胞缺乏如何影响CNS的B细胞，流式发现B细胞（B+CD3?）的浸润CD4CreBcl6fl/fl小鼠CNS程度较低（图4d，补充图10e）。2D2tgCD4CreBcl6fl/fl小鼠进一步证明（r?=0.70，p?0.05）。在CD4CreBcl6fl/fl小鼠中，Bcl6缺乏的Pan-T细胞会影响EAE靶向Tfh细胞和滤泡T调节细胞（TFR）启动阶段。2D2tgCD4CreBcl6fl/fl小鼠，它们表达识别MOG的T细胞受体转基因，从而能够实现免疫独立的过继转移EAE诱导。在将产生白介素（IL）-17的髓磷脂反应性Th细胞转移至野生型宿主后，2D2tgBcl6fl/fl对照T细胞诱导的EAE比Bcl6-deficient2D2tgCD4CreBcl6fl/fl严重得多（图4e）。尽管CD4CreBcl6fl/fl供体细胞的转移前极化相当（补充图10f）。对照组在CNS中显示出Bcl6-deficientTcells更高的B细胞比例（图4f）。MS患者（n?=7）与对照（n?=6）的CSF中分选出的Tfh细胞进行了大批量RNA测序，没有基因达到差异表达的显著性阈值（补充图12c，补充数据集10）。表明CSF驻留的Tfh细胞的丰度增加，但在MS中并未显著改变其表型。GSEA发现了MS衍生的Tfh细胞中与T细胞记忆和致病性相关的基因集（不是单个基因）的富集（p?0.01，Bonferroni校正；补充数据集10）。基因在这些富集基因组重复（补充图11）与细胞*性（例如，GZMA，GZMK，CASP3，和CASP4）和共抑制功能（例如，KLRG1，TIGIT，和CTLA4）相关联。表明Tfh细胞在中枢神经系统中局部驱动B细胞反应，并促进MS样自身免疫。数据
本研究RNA-seq数据登录号为GSE，scRNA-seq登录号为GSE266。所有处理过的原始scRNA-seq数据（差异表达数据，GSEA和CSEA数据）均包含在“补充数据集表”中。scRNA-seq技术信息和数据表以及所含患者的详细信息均列在补充表中。代码可用性
用于复制此手稿中单细胞测序结果的代码已保存在