成功案例联合RNAseq揭示周围神 - 多发性硬化

TUhjnbcbe - 2021/11/11 8:17:00

白癜风治疗医院 https://wapjbk.39.net/yiyuanzaixian/bjzkbdfyy/

英文题目：Myelinsheathstructureandregenerationinperipheralnerveinjuryrepair

中文题目：髓鞘结构和在周围神经损伤修复中的再生

发表杂志：PNAS

影响因子：9.58

合作单位：西南大学淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室

年10月14日，西南大学淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室、重庆市畜牧科学院、美国芝加哥大学与北京百迈客生物科技有限公司合作的转录组研究文章发表在美国国家科学院院刊(ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,PNAS)。该研究首次揭示了如果没有亲脂素（PLP-1）颗粒的锚定就无法形成正常结构的髓鞘，从而导致神经系统疾病。

研究方法

材料：SPF级SD大鼠透射电镜（TEM）：坐骨神经断裂端端吻合、坐骨神经缺损的自体神经移植和神经管移植、坐骨神经、视神经和动眼神经免疫荧光染色：分别使用MBP和GFAP免疫荧光试剂盒鉴定成髓鞘雪旺细胞和非髓鞘雪旺细胞。用NGFRP75）和NF分别鉴定雪旺细胞和轴突。RNA-seq：术后神经移植体、坐骨神经和原代培养的雪旺细胞

研究背景

众所周知，神经系统由神经纤维构成，大部分神经纤维由轴突和包裹在其外的髓鞘构成。髓鞘结构异常可导致各种神经疾病（如，阿尔茨海默病、多发性硬化症等），在损伤修复过程中全面了解周围神经中髓鞘的结构和再生将有助于理解各种神经疾病的发病机制和治疗。

构成髓鞘的膜由蛋白质(20-30%)和脂质(70-80%)组成。这些蛋白质包括髓鞘碱性蛋白（MBP）(30-40%)和脂蛋白(PLP)。亲脂素（PLP-1）约占PLP的50%。MBP与髓鞘的致密有关，而亲脂素可能与髓鞘的锚定有关（图1）。MBP位于膜的内表面，使其带正电荷并具有疏水性。MBP和带负电荷的脂质分子相互吸引，从而“吸附”到细胞膜的内表面。在形成髓鞘的过程中，胶质细胞被挤压成片层，使两层细胞膜彼此接近，并且MBP的正电荷与细胞膜上带负电荷的脂质分子相互吸引，从而使两层细胞膜更加稳定地结合。它们一起形成由2层细胞膜组成的双层结构，每层细胞膜具有2层脂质分子。在双层结构中，两层细胞膜相隔3~8nm，并由胶质细胞的细胞质填充。这是构成髓鞘的结构单元，称为主要致密线（MDL）。然而，双层结构与髓鞘和MDL的致密之间的关系仍有待于充分阐明。

图1髓鞘(双层)和颗粒的结构单位

研究结果

1不同类型神经的髓鞘结构

透射电镜观察显示：视神经、动眼神经和坐骨神经横切面髓鞘厚度有显著差异。动眼神经和坐骨神经中有不同厚度的髓鞘。在视神经中，大多数髓鞘比动眼神经和坐骨神经的髓鞘薄(图2A)。注释束(图2A，III)在动眼神经和坐骨神经的横断面上比视神经更容易观察到。在所有3种神经的髓鞘上观察到颗粒(图B中的白色箭头表示)。MDL（majordenselines，主要致密线）在由MSCs（myelinatingSchwanncells）形成的多层结构单元组成的多层髓鞘中显著存在(图2B)。相反，在坐骨神经的横切面(图2C)，由围绕C纤维的NMSCs（nonmyelinatingSchwanncells）形成的不分层髓鞘(图2C中的2个黑色箭头之间)由单层结构单元组成，并且MDL不显著。

图2视神经、动眼神经和坐骨神经横断面的TEM图像

2周围神经损伤修复过程中的髓鞘结构

于端端吻合术后第30天进行透射电镜观察。结果表明，无论是坐骨神经的远端还是近端，髓鞘的结构都没有明显的异常。自体神经移植和神经管移植术后第30天，坐骨神经远端和近端髓鞘结构均未见明显异常。

图3术后第30天采集标本近端和远端横切面的TEM图像

在大鼠神经损伤模型(10mm)中进行坐骨神经端端吻合术，术后第30天制作冰冻切片进行免疫荧光染色。结果显示MBP和GFAP在坐骨神经远端和近端均呈阳性(图4A)。在大鼠神经损伤模型(10mm)的坐骨神经缺损进行自体神经移植，术后第30天再次进行免疫荧光染色。MBP和GFAP在坐骨神经的远端、近端和移植物中均呈阳性(图4B)。

图4术后30天取标本进行DAPI、MBP、GFAPNGFRP75、NF免疫荧光染色

大鼠坐骨神经缺损10mm处进行神经管移植，术后第30天取材（神经管内生长锥），冰冻切片进行免疫荧光染色。结果显示NF、NGFRP75、MBP和GFAP均为阳性(图5)。

图5DAPI，MBP，GFAPNGFRP75和NF免疫荧光染色于移植后第30天采集的神经管内生长锥横切面

自体神经移植后第30天对移植物进行透射电镜观察，观察到一些结构异常的髓鞘。所有的髓鞘(图6A中标记为M1，M2，M3和M4)都有MDL和颗粒。M1和M2由细胞膜连接(图6A中的白色箭头)，表明它们是由相同（同一个）的Schwann细胞形成的，而M2位于M1内部，它们内部有轴突。M3和M4也由细胞膜连接(图6A中的白色箭头)，表明它们也是由相同的Schwann细胞形成的，但它们内部没有轴突。在神经管移植后第30天，在生长锥中观察到不同直径的髓鞘(图B、C)，这些髓鞘相对松散，他们有MDL，但没有锚定颗粒。自体神经移植组(图6A)再生的神经纤维有结构异常，尽管其髓鞘结构正常：即髓鞘致密，有主要的致密线和锚定颗粒。这些结构异常是：①同一个Schwann细胞形成2个髓鞘；②髓鞘包含在另一个髓鞘内；③髓鞘内没有轴突。由于这些髓鞘致密且有主要的致密线和锚定颗粒，这表明这些异常结构可能不是由MBP和亲脂素（PLP-1）决定的，而是由其他因素决定的，因此需要进一步的研究来确定这些因素及其作用。

图6术后第30天采集标本横切面的TEM图像

3亲脂素（PLP-1），MBP，GFAP，NF和NGFRP75在坐骨神经损伤修复过程中的表达

一般来说，端到端吻合比自体神经移植更容易修复，而自体神经移植优于神经管移植。修复这些神经损伤的难度顺序与上述各组亲脂素和MBP表达的差异一致。因此，亲脂素和MBP在各组中表达水平的差异与各组中髓鞘的数量呈正相关。

第7天和第14天GFAP的相对表达水平依次为：神经管移植自体神经移植端到端吻合。第30天此顺序改为：端对端吻合自体神经移植神经管移植(图7)。NGFRP75的相对表达水平没有显示出明显的趋势，无论是基于组还是时间点。与正常坐骨神经的表达相比，NF在每个时间点在各组中的表达几乎总是低于正常坐骨神经。NF的表达水平在不同时间和不同组之间均无明显变化趋势。

在体外培养的Schwann细胞中，NF的表达水平低于正常坐骨神经，表明NF的表达水平与轴突含量呈正相关。自体神经移植后第14天和神经管移植后第30天，NF的表达均高于正常坐骨神经，提示轴突生长活跃。它还表明修复活动具有不同的特征，并且发生在不同的时间过程中。

图7亲脂素、MBP、GFAP、NF和NGFRP75在端对端吻合组、自体神经移植组、神经管移植组和原代培养的Schwan细胞中相对于正常坐骨神经的表达水平

结论

1）轴突的直径和雷马克束（Remarkbundle）的有无，不能作为区分传出和传入神经纤维的依据。

2）“双双层”结构是构成髓鞘的结构单元。成髓鞘雪旺细胞包裹单根轴突形成神经纤维，所形成的髓鞘由多层“双双层”结构缠绕而成。非成髓鞘雪旺细胞包裹多根轴突（C-fiberin）形成雷马克束（Remarkbundle），所形成的髓鞘由单层“双双层”结构缠绕而成。

3）髓鞘的压实包括两个步骤，即：“双双层”中的两层雪旺细胞膜相互靠拢，然后紧密地结合在一起，从而形成致密线。

4）MBP的表达量与致密线的形成成正相关，PLP-1所形成的颗粒的锚定作用，是髓鞘压实的必要条件。

5）在自体神经移植中，髓鞘异常结构的发生，与PLP-1和MBP的表达无直接相关性。