与传统的诱导抗原特异性免疫反应的蛋白/肽的疫苗相比，DNA疫苗会更稳定，更经济，更容易生产和更安全[1]。DNA疫苗正被研究用于各种各样的应用，包括癌症[2]的治疗，过敏[3]，自身免疫疾病[4]和传染病[5]。在美国，目前有超过个以DNA接种疫苗为重点的临床试验注册，尤其在针对病*感染[6]和癌症[7]，然而细菌感染和自身免疫疾病则不是一个热门的话题。临床试验中检测的大量DNA疫苗强调了他们对未来的医学方面的重要作用。这篇综述目的在于总结优化DNA疫苗设计给药方法发面的最新成就和进展。
2.DNA疫苗的作用过程疫苗释放的经典方式是肌肉注射，皮肤内注射和皮下注射，它首先分别作用于主要的肌细胞[8]和角化细胞[9]，同时作用于近注射侧的抗原呈递细胞（APC）[10]（图1）。在DNA疫苗的作用下，内化后DNA需要在细胞核内转录，随后在细胞质翻译[11]。
图1.DNA疫苗诱导适应性免疫应答
一种DNA疫苗想要诱导适应性免疫应答需要编码一个抗原和一个佐剂。根据质粒DNA被用于系统和局部，例如，通过肌肉注射。通过外泌体或者凋亡细胞转染角质细胞或者肌细胞表达转基因和释放衍生的肽、蛋白。这种材料被树突状细胞（iDC）被吞噬，随后树突状细胞优先的呈送抗原，通过主要的组织相容性(MHCII）到淋巴结的CD4+T细胞。APC的直接转染包括iDC内生转基因表达结果，和类似的通过MHCI和MHCII呈递过程，同时产生CD8+和CD4+T细胞反应。除了这种细胞免疫反应外，如果B细胞受体识别出蛋白抗原就会产生体液免疫反应，同时通过预先激活抗原特异性CD4+T细胞获得帮助。
APC可以通过DNA疫苗直接转染[10]。在这种情况下，编码抗原被表达，处理后抗原多肽被平行加载到MHCI和MHCII分子上[12]。在同时激活的情况下，抗原呈递APC迁移引流淋巴结，可以启动CD8+andCD4+T辅助细胞。
在皮肤应用中，转染的角质细胞可产生抗原，抗原由外泌体和凋亡细胞释放，由APC内化[14]。一般来说，外源性抗原完全被装载到MHCII上，导致CD4+T辅助细胞被激活，而CD4+T辅助细胞活化反过来又促进B细胞的启动，从而产生体液免疫反应并且需要CD8+T细胞的完全活化[15]。到目前为止，只有具有交叉启动电位的树突状细胞亚群（DC）能够将内在化的抗原加载到MHCI上[16]。
肌内应用后转染的心肌细胞可能发生凋亡。凋亡体被APC吞噬，外源性抗原在MHCI上交叉呈现，导致CD8+T细胞反应[17]。早期DNA疫苗研究表明，CD8+T细胞*性T淋巴细胞（CTL）的启动主要依赖于骨髓来源的DC，而非组织特异性细胞诱导[18]，并且严格依赖，CD4+T细胞帮助[19]。
DNA疫苗最大的挑战是想要诱导一个抗肿瘤免疫应答，抗肿瘤免疫应答归因于肿瘤免疫逃避策略[20]。在这方面，肿瘤细胞通常以抗原处理缺陷为特征，然后通过MHCI呈递[21]，MHCI表达受损[22]。此外，在肿瘤微环境中，实质和浸润的免疫细胞都可能过度表达促进耐受的非经典MHCI分子，如人白细胞抗原（HLA-G）和HLA-E[23]。此外，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）通过多种机制保护肿瘤免受免疫应答，包括抗炎病*白介素-10的释放和表面受体的表达，如程序化死亡配体1，抑制活化T细胞的功能[24]。CD4+CE25+FoxP3+调控T细胞促进肿瘤生长，抑制T效应细胞[25]，降低DNA疫苗的有效性。而且，TAM-和肿瘤源性介质均促进骨髓源抑制细胞（MDSC）的扩增，MDSC干扰肿瘤微环境中T细胞的活化，并促使T效应细胞的衰减[26]。
3.DNA疫苗在临床中的应用DNA疫苗的使用早就引起了人们安全性的担忧，主要是转染的DNA稳定整合到体细胞甚至生殖细胞基因组，导致基因表达失调和突变的可能性。在这方面，Wolff和他的同事证明了肌内给药后的荧光素酶-编码载体在肌肉注射后骨骼肌中存在超过19个月，但只是作为一个染色体外质粒[27]。然而，Wang等人报道，肌内注射后电穿孔显著提高了转染率，这与载体DNA在随机位点的低水平染色整合有关[28]。然而作者计算出，整合频率远远低于自发基因的突变数量。在随后的一项研究中，注射到不同啮齿动物骨骼肌中的大部分质粒DNA仍停留在注射部位，而在包括性腺在内的其他器官中也检测到了少量的质粒DNA，但没有整合到基因组中[29]。针对不需要的DNA疫苗相关免疫效应，灵长类动物肌内反复应用荧光素酶编码的报告载体，导致报告载体长期表达，但未诱导抗DNA抗体[30]。潜在的DNA疫苗原核元素转移，如抗生素耐药基因进入肠道微生物组被认为是另一个完全问题，但到目前为止还没有记录到此类事件[31]。尽管如此，在临床应用中需要考虑上述问题以及DNA疫苗的其他安全性问题[32]。
目前，还没有被批准用于人体的DNA疫苗。尽管如此，一些基于DNA的疫苗还是被FDA和USFDA批准用于兽医，包括一种针对马西尼罗病*[33]和犬黑素瘤[34]。第一批用于人类的DNA疫苗临床试验评估了对艾滋病的治疗和预防效果，在这些试验中未检测到显著的免疫应答，但检测到潜在的免疫原性[35]。然而在同一年，Wang和他的同事证明了混合编码不同恶性疟原虫蛋白[36]的质粒免疫灵长类动物后CD8+T细胞反应的诱导。另一项以乙肝病*为靶点的临床试验显示，对传统疫苗接种无效的患者会诱导体液反应[37]。DNA疫苗的总体安全性已在几项临床试验中得到充分证明，突出的事实是，没有观察到针对DNA疫苗原核部分本身的抗体反应，而且不良反应仅限于注射部位的轻微局部反应[2]。
年进行了第一批使用DNA疫苗进行肿瘤治疗的临床试验之一，使用前列腺膜抗原作为前列腺癌抗原，使用腺病*载体和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子作为佐剂。本试验观察到延迟型I超敏反应[38]。因此，后续试验的目标是改进这个参数[39]。黑素瘤患者接种含有编码黑色素-A和络氨酸酶的双价DNA作为肿瘤相关抗原的疫苗，可在IV期病人阶段引起体液和CTL反应[40]。随后的一项临床试验使用了编码四肽的synchrovax疫苗，由T细胞1识别的黑色素-A和黑色素瘤抗原表位可诱导广泛的抗原特异性CD8+T细胞反应[41]。本试验显示抗原特异性反应，但未诱导患者肿瘤消退。最近的临床试验表明，使用编码两种不同CD8+T细胞表位[42]的DNA疫苗，在诱导Wilms’肿瘤抗原1的免疫应答方面取得了良好的效果。
总而言之，使用DNA疫苗的临床试验诱发了细胞和体液反应的有效诱导[2]。然而，这些反应的水平往往不足以产生显著的临床效益。因此，大量的临床试验集中于DNA疫苗优化策略，以增强其免疫原性如下所示[7]，此外，有必要比较不同DNA疫苗接种途径对有效的适应性免疫反应的适用性。在这方面，皮肤和粘膜HIV疫苗（CUTHIVAC）接种试验值得提及，因为它的目的是比较分析不同注射部位联合电穿孔或不电穿孔[43]的影响。下面介绍了DNA疫苗设计的优化策略和改进其向APC传递的方法。这两个方面都是克服DNA疫苗在人体内免疫原性差的重要方面。
4.DNA疫苗的优化DNA疫苗要成为一种有效的工具仍面临许多挑战，因为它们在临床前研究汇总取得的成功尚未转化外临床兽医[44]。最大的挑战是DNA疫苗在较大动物和人类中的低免疫原性，这可能是由于难以提高小动物系统中使用的DNA疫苗的数量[45]。为此，需要将大约5-20mg的DNA注射到一个中等大小的人体[46]。如果无装饰的，未配置质粒DNA用于疫苗接种，导致治疗效率低下的一个重要因素是DNA降解[47]。研究表明，与其他给药形式如微环相比，质粒在一周内降解速度相对较快[48]。成功进入细胞的DNA分子细胞需要通过核膜的屏障才能被转录[11]。因此，由于在体内转染给定目标细胞时可处理的DNA量较低，因此转染的优化是主要目标。图2总结了DNA疫苗设计的优化参数。
图2优化DNA疫苗设计参数
使用病*/真核生物混合启动子可以防止病*启动子的转录沉默。另外，可以使用一种设计成转录靶向APC（如DC）的启动子。为了提高抗原的表达，特别是在病原体的情况下，密码子优化是非常重要的。为了诱导广泛的CD4+/CD8+T细胞反应，可以使用编码不同抗原的链接分离序列。另外，与编码不变链的序列融合可以增强抗原对MHCII的负荷。传统上，旨在增强APC激活状态和/或者对T细胞的吸引和极化作用的分子佐剂是通过与DNA疫苗协同作用的表达载体编码的。为保证抗原和分子佐剂在转染细胞中的共表达，两种序列必须均被纳入DNA疫苗中（incis），通过IRE或者T2A序列分离。脊椎骨载体包含DNA疫苗的一部分，而真核表达并不需要DNA疫苗。危险受体检测到固有或插入的免疫刺激序列，介导APC活化。NLS的内含物促进了DNA的核进入。主干对转染效率的内在抑制作用受到A/T富集序列插入或重组酶介导的原核部分缺失的限制，原核部分是细菌繁殖产生微环DNA的最后一步。
4.1启动子传统上，病*启动子，例如人的即时/早期CMV（巨细胞病*）启动子被广泛应高度用于驱动转基因表达[49]。然而，尤其是长期表达方面，病*启动子往往受到甲基化介质的失活，而真核启动子和杂交体真核/病*启动子仍然活跃[50]。此外，细胞类型-特异性启动子的使用可能会限制抗原在APC中的表达。
为了实现DC的转录靶向性，激活状态下的DC是最有效的APC群体[13，51]，测试了内源性基因的各种启动子，这些启动子主要表达在这个APC群体中，以驱动DC为中心的转基因表达。CD11c已经在小鼠中很好的确立了作为DC特异性标记物的地位[52]，而这β2个整合素通过不同的免疫细胞类型在人类中更广泛地表达[53]。在大的5.5kb启动子片段转录控制下表达抗原的转基因小鼠显示DC特异性转基因表达[54]。然而，当小鼠含有CD11c启动子片段的DNA疫苗进行生物质体转染时发现CTL激活不足[55]。树状细胞表达的七种跨膜蛋白（DC-STAMP）构成了一个进化上高度保守的内质网横跨膜蛋白[56]。在同一研究中，DC-STAMP主要在未成年人和小鼠DC中表达，并随着成熟而下降。然而破骨细胞和巨噬细胞同样表达DC-STAMP[57]。通过携带慢病*表达载体的造血干细胞转导DC-STAMP启动子驱动荧光报告基因表达[58]，评价DC-STAMP启动子对转录靶向DC的适用性。用转导物对致死辐照小鼠进行重组，并在不同免疫细胞类型汇总监测报告基因的表达。事实上，报道者主要通过分化的常规和浆细胞样DC，以及低水平的单核细胞、B细胞和NK细胞表达。Dectin-2（CLEC6A）是一种C-型凝集素受体（CLR），集合多种病原菌[59]富含甘露糖的表面结构，主要由构成表皮DC种群的胰岛细胞（LC）表达[60]。在本研究中，利用报告质粒驱动Dectin-2启动子表达荧光素酶小鼠，经启动子转染得到LC中占优势的报告基因表达[61]。在随后的研究中，在Dectin-2启动子控制下，慢性*报告子表达载体转导小鼠，导致报告子在LC和巨噬细胞中表达[62]。比较研究包括上述基因启动子和树突的启动子片段特异性细胞间粘附分子-3-抓取非整合蛋白（DC-SIGN）基因编码产生一个CLR主要表达的DC和巨噬细胞[59]，在DC转染后，DC-STAMP启动子被认为最有效的体外诱导抗原-特异性T细胞反应[63]。
高度保守的肌动蛋白Fascin-1在神经元细胞中高度表达，介导轴突的结构完整性[64]。我们发现，除了神经元外，Fascin-1仅在小鼠和人类活化DC中表达[65]。Fascin-1启动子在两物种DC中均表现出比较强的特异性活性[66，67]。在随后的研究中，我们证明了DC的转录靶向性是通过含有Fascin-1启动子的DNA疫苗来驱动的，抗原表达产生抗原特异性T辅助细胞偏倚免疫反应，而转染CMV启动子-驱动的DNA疫苗导致Th1/Th2反应混合[68]。此外，含有DNA疫苗的Fascin-1和CMV启动子在可比程度上也可诱导CTL[66]。在各种过敏原诱导的气道炎症和I型过敏小鼠模型中[69]，以及小鼠多发性硬化模型[70]，在Fascin-1启动子的控制下，用编码相关过敏原/抗原质粒集中治疗多发性硬化显示出疗效，尤其是在编码抗炎细胞因子的共转染表达构建物中显示出疗效。DC的转录靶向性是为了将抗原和佐剂的表达限制在这个APC群体中，从而防止像MDSCTAM这样的调节细胞类型处理耐受问题。然而，DC的转录耙向性也会在很大程度上排斥（蛋白）抗原在B细胞的表达，从而可能损害抗原特异性抗体的诱导。额外的B细胞定向可以通过使用同样APC种群中显示活性的细胞启动子来实现[51]。
4.2抗原在感染性疾病或肿瘤治疗中使用DNA疫苗，可以将重点放在编码特定病原体或肿瘤特异性蛋白的免疫原性多肽的序列上，并允许在一个微基因内包含来自不同蛋白的抗原编码序列，从而诱导更广泛的T细胞反应[71]。肿瘤细胞表达的抗原称为肿瘤相关抗原（TAA），可分为肿瘤特异性共享抗原和肿瘤特异性特异抗原两大类[72]。共享抗原由不同肿瘤表达，也可以存在于不同组织的正常细胞中，虽然数量较少。肿瘤特异性的抗原即新抗原，仅通过（个体）肿瘤表达[73]。共享抗原使用更方便，因为大多数蛋白质的序列是已知的，而且不需要对突变组进行遗传分析来选择抗原编码序列[74]。然而，使用共享TAA的一个主要风险是诱导自身免疫反应，因为免疫系统也会对表达的抗原的健康组织产生不利影响[75]。如果设计DNA疫苗，新抗原似乎是首选，因为研究表明效应T细胞对突变抗原的反应更强[76]。此外，具有较高半哀期的抗原已被证明可诱导更强的细胞*性T细胞反应，从而增强免疫原性[77]。
如果目标抗原是非人源的，并且能够增强抗原表达，密码子优化是最需要的[62]。此外，如果已知抗原的免疫原性多肽，且不存在诱导目标蛋白特异性抗体的问题，则可能只包括编码相关T细跑抗原表位的序列[78]。即使编码抗原高表达，抗原的递呈/识别仍可能是引起足够免疫反应的障碍。这个问题是通过在抗原中引入表位特异性改变来增加MHC亲和力来解决的[79]。类似的研究也在努力增加MHC/肽复合物与T细胞受体的亲和力[80]。增加抗原呈递的最新方法使用外源性抗原[81]。这种方法在开发USDA-批准的抗犬黑色素瘤DNA疫苗方面非常成功。在目前的研究中，既采用编码完整蛋白作为抗原来源的DNA疫苗接种策略，也采用编码不同肽抗原的DNA疫苗接种策略。而前者的目的是诱导细胞和伴随物的体液免疫反应，后者的重点是诱导T细胞反应以牺牲抗体的产生。抗原编码表达单元的设计包括几个免疫原性抗原来自一个或不同的蛋白质递呈，通过MHCI/II与CD4+/CD8+T细胞平行激活，例如通过引入不变链以促进MHCII抗原的呈现来实现密码子优化的最终策略。
4.3佐剂为了避免诱导疫苗介导的抗原特异性耐受，APC需要被一个所谓的危险信号激活，该信号促进抗原呈递受体、共刺激因子和促炎介质的负转录调控，从而有效激活T细胞并极化[13]。为此目的，抗原编码疫苗已与已建立的佐剂如铝佐剂[82]或成免疫刺激CpG寡核苷酸共同给药，这些佐剂与核内体定位的toll-样受体(TLR）9结合以刺激APC[83]。质粒的皮内应用可抑制位于氨苄西林耐药基因内富含CpG的偏倚免疫反应[84]。除了TLR9外，介导干扰素基因信号通路刺激物激活的细胞质DNA传感器也参与了DNA疫苗的内在佐剂作用[85]。
除了质粒DNA的内在佐剂作用外，质粒编码转录因子为遗传佐剂的质粒协同传递也已被检测可刺激APC。活化B细胞（NF-kB）[86]的核因子“kappa-light-chain-enhancer”和干扰素调节因子(IRF)[87]家族转录因子上调激活是危险信号刺激APC的标志。Shedlock和同事已经证明，通过在小鼠体内电穿孔构建一种编码DNA疫苗的HIV蛋白和NF-kBp65表达的共同递呈提高了细胞和体液免疫应答[88]。流感抗原编码的DNA疫苗和IRF-3编码载体共同递呈经小鼠启动子转染可导致活化的CD4+和CD8+T细胞增多[89]。与IRF-1表达载体共转染可增强病*抗原特异性抗体的产生，而IRF-7的表达增强可增加T细胞和B细胞的应答。然而，与肌肉注射的HIVtat抗原DNA疫苗联合使用时，只有IRF-1编码载体的协同递呈才能提高预期的CTL/Th1应答[90]。为了实现IRF和NF-kB转录因子的共激活，Luc和同事使用编码DNA疫苗的流感蛋白和编码病*诱导的信号转导蛋白的质粒免疫小鼠，从而导致抗病*T细胞反应升高[91]。在对比研究中，Larsen和同事评估了众多不同TLR信号转接器的共表达载体增强免疫应答的能力[92]。在17个不同的信号转器检测中，在体内只有联合使用Tak1和Tram表达载体才能增强体内CLT反应。
上述策略旨在增强转染APC的激活状态。在其他方法DNA疫苗与质粒联合接种，它们既可以编码共刺激受体转染APC来增强它们的T细胞刺激能力，也可以编码报告的CD80和CD86。例如，Andrés和他的同事在免疫的绵羊中发现强烈的抗绵阳脱髓鞘性脑白质炎/羊慢性进行性肺炎病*T细胞和抗体应答[93]。更常见的情况是，DNA疫苗与可溶性介质如细胞因子或趋化因子的表达结构共同递呈，这些可溶性介质在APC和其他免疫细胞中发挥刺激/趋化作用[13]。例如，IL-12是通过活化APC产生的，促进Thl分化，同时也刺激APC自身[94]。因此，肌内电穿孔联合IL-12表达构建与多基因HIVDNA疫苗联合使用可增强健康志愿者体内抗原特异性CD4+和CD8+的活化[95]。1L-15也通过活化DC释放，对效应因子CD4+和CD8+T细胞、B细胞、NK细胞以及DC具有广泛的刺激作用[96]。在几项研究中，观察到IL-15共转染的显着效果，如Sun和同事证明了将一种分枝杆菌抗原和IL-15肌肉注射到小鼠体内的融合结构产生了显著的NK活性，增强了ThI和CTL反应，并提高了抗体效价[97]。综上所述，不同的细胞因子作为基因佐剂同时刺激APC和其他类型的免疫细胞[45],，而IL-2主要作用于T细胞(和NK细胞)[98]。因此，其过表达的目的是支持耗尽的T效应细胞的持续激活，并通过调节性T细胞克服其耗尽[99]。近年来，通过表达或过表达细胞内或分泌因子来促进APC和T细胞活化的替代方法，RNA干扰调控细胞活化的概念受到