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Qi
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翊竑
#唐氏综合征#（Downsyndrome,DS），也叫21三体综合征，是最常见的先天性染色体异常，大约每名新生儿中就有1名唐氏患儿。免疫失调是DS的一个核心特征，临床表现为对许多自身免疫性疾病的易感性大大增加，因而了解21号染色体上个基因的三倍体如何重塑免疫全景图谱对于合理选择和开发专门减轻DS相关自身免疫病症的疗法至关重要。
先前的研究已经确定了与自身免疫相关的DS中免疫重塑的几个特征，包括免疫细胞亚群的改变，例如增加的记忆T细胞：幼稚T细胞比率，升高的促炎细胞因子循环浓度，以及对1型干扰素的过度反应。然而目前，仍有以下问题需要给出解释：1）DS如何影响整个生命周期的免疫重塑；2）免疫重塑的哪些特征是DS特异性的；3）1型干扰素和其他细胞因子在DS特异性免疫重塑中的作用；4）DS中的免疫重塑与自身免疫中的免疫重塑有何相似之处。此外，先前的研究通常集中在患有DS的儿童或成人群体，缺乏对整个生命周期免疫变化的全面研究。因此，关于DS中免疫系统的加速老化所起到的作用，以及在生命周期中免疫系统老化的差异何时开始，以及这些差异是否会引起DS相关合并症的发生仍不清楚。
近日，来自美国弗吉尼亚梅森大学贝纳罗亚研究所的BernardKhor团队在ScienceTranslationalMedicine杂志上发表了一篇题为Deepimmunephenotypingrevealssimilaritiesbetweenaging,Downsyndrome,andautoimmunity的文章，他们通过评估一组2至55岁自身免疫性疾病发生率低的DS患者、年龄和性别匹配的健康对照者（TC）、以及I型糖尿病（T1D）患者的免疫情况来研究上述问题。研究人员开发IMPACD（IterativeMachine-assistedPermutationalAnalysisofCytometryData）分析软件，发现DS患者幼稚T细胞存在广泛失调，并将IL-6确认为部分变化的候选驱动因素。此外，研究人员还利用IMPACD提供的免疫子集构建了量化免疫系统老化的线性模型（免疫时钟），定量地证明了DS中的早期免疫老化现象。这些发现增进了当前对于患有或不患有DS的个体的免疫结构改变的理解。
为了确认可能导致自身免疫疾病的DS中相关免疫失调的特征，研究人员使用CyTOF对来自28名DS患者（年龄2至55岁）的外周血单核细胞(PBMC)、28名年龄和性别匹配的健康个体以及25名T1D个体进行免疫表型分型。结果显示DS群体的B细胞、CD4+效应T（Teff）细胞和CD8+T细胞的绝对数量减少，而不同队列间的Treg细胞数量相当；CD3+CD56+NKT细胞在DS和T1D组中增加，在T1D中仅略微增加。鉴于T细胞和B细胞是DS中定量改变最多的细胞亚群，研究人员接下来评估了这些细胞的定性重塑。其中，DS中幼稚CD4+Teff和CD8+T细胞的频率降低，而包括干细胞样记忆T细胞（TSCM）和效应记忆T细胞（TEM）等在内的记忆T细胞亚群的频率增加，记忆T细胞：幼稚T细胞比率的增加是由DS中幼稚T细胞的绝对数量减少所驱动的。相反，DS个体PBMC的B细胞亚群中，除了浆母细胞（PBs）之外的大多数记忆B细胞亚群的绝对数量减少，且CD4+NKT细胞的比例降低。然而，来自于T1D个体的PBMC中T细胞、B细胞以及NKT细胞的失调明显弱于DS组。
为了克服批次内（CyTOF中超过40个标记引起高维细胞计数手动门控分析的不一致性）和批次外（对门的重新调整和应用）效应，研究人员开发了一个软件工具IMPCD，读取标准流式细胞分析文件，使用统一后的阈值将每个细胞二值化为各标志物的阳性或阴性，以此再次确定DS、T1D和TC组的免疫结构差异。基于T、B和NKT子集的“根节点”，研究人员进一步完成多达三个附加标记的所有排列。每个子集被描述为包含“根节点”、0到2个“修饰节点”和“终端节点”在内连续标记的“路径”（图1）。IMPCD共确定了个子集或各标志物表达的组合，通过主成分分析（PCA）和无监督层次聚类分析可以轻易将DS与混合的TC及T1D个体区分。研究人员继续对这些子集进行分类，DS中失调的亚群相对集中在幼稚CD4+细胞、幼稚CD8+细胞、记忆B细胞和CD8+NKT细胞中。
图1.研究设计流程图
图2.由根节点、修饰节点和终端节点构成的不同子集示意图
失调的B细胞和T细胞稳态也是许多自身免疫反应的关键特征，研究人员发现DS中B细胞的重塑与自身免疫性疾病有许多共同特征，比如说CD11c在非浆母细胞类的B细胞亚群中表达增加；同样地，CD11c也在类风湿性关节炎（RA）、系统性红斑狼疮和多发性硬化症中表达上调；类似的例子还有PD-1，PD-1在非浆母细胞类的B细胞亚群中表达增加，同样也在RA中增加等。此外，DS中的T细胞重塑也表现出与自身免疫性疾病的许多共同特征，比如记忆Treg细胞中CD39和CD73的表达增加，也在RA患者中也可观察到类似的变化。
需要注意的是，根据IMPCD分析，研究人员发现DS患者的幼稚CD4+和CD8+T细胞处于过度活化状态，为了探索是何种细胞因子引起DS中幼稚T细胞的失调，研究人员检测了TC个体的T细胞在没有T细胞受体刺激的情况下对IFN-β和IL-6的反应，一方面是因为21号染色体编码的TNF受体亚基过表达，IFN信号传导增强，另一方面IL-6与自身免疫相关，且在DS患者血清中水平上调。出乎意料的是，作者发现用IL-6而非IFN-β处理TC的T细胞后出现了在DS患者中发现的T细胞标记物表达的增加（CD39、TIGIT和CXCR3）。此外，全血RNA-seq的GSEA结果揭示了IL-6/JAK/STAT3信号通路的富集，进一步支持了IL-6在DS相关免疫失调中的作用。
接下来，研究人员试图利用队列的广泛年龄范围来确认这些特征如何在患有和未患DS的人中随年龄而变化，比如说与TC相比，DS中的幼稚T细胞随年龄增长而加速减少，促炎细胞因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6等虽然升高，但在任何队列中均未表现出线性增加。在这些发现的基础上，作者对TC个体的CyTOF数据进行训练，建立了三个模型（称“免疫时钟”）：1）在“未过滤”模型中，作者利用IMPCD的高维输出来评估TC个体确定的个子集中的每一个，并发现61个子集与TC中的年龄呈线性相关；2）用PCA构建了一个基于本研究中27个子集的模型，而这些子集也在先前的研究中被发现随年龄变化而变化（Alpert过滤模型）；3）从IMPCD确定的个子集中确定了41个与TC个体呈线性相关的子集（DS过滤模型）。利用这些模型来比较DS患者的“免疫年龄”。所有三个时钟均显示DS患者的早期免疫老化，而DS过滤模型显示DS患者的免疫年龄与平均年龄大16.9岁的个体相似，且从队列的最小患者就观察到这种差异，说明DS中的免疫老化始于儿童时期。如果将T1D个体的免疫年龄与实际年龄比较后发现，DS过滤模型显示T1D个体的免疫系统类似于平均年龄大3.9岁的TC个体。
图2.针对TC个体的CyTOF数据进行训练建立的三个“免疫时钟”模型
总的来说，这项研究通过开发IMPACD软件，显著提高了手动门控分析的严谨性和一致性，鉴定出与其他自身免疫性疾病共有的DS免疫失调的许多特征，并指出21-三体与自身免疫风险的增加相关，并可能通过提高自身免疫风险的方式来改变免疫结构。然而，由于样本量的限制，本研究无法捕捉每个队列内不同个体免疫年龄的异质性以及获悉队列之间更细微差异，未来需要更大规模的研究以确定哪些亚群与免疫年龄的相关性最强。
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